脂多糖所致小鼠睾丸支持细胞GDNF表达减少对精原干细胞的影响

摘要

目的及意义:
　　 睾丸炎(Orchitis)是男性生殖系统常见的非特异性感染，可影响精子的数量和质量，严重者还可导致不育。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)又称内毒素，是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，也是感染发生时诱导睾丸细胞发生炎症反应的重要物质，腹腔注射LPS可建立大鼠睾丸炎模型。因此，探讨LPS在睾丸炎所致不育中的作用机制，具有较高的临床应用价值。
　　 精原干细胞(Spermatogonial Stem cells，SSCs)位于睾丸生精小管基底膜上，是体内自然状态下唯一能将遗传信息传至子代的成体干细胞，它既能通过自我更新保持自身数量的稳定，又能通过一系列的分化过程最终形成精子，SSCs自我更新和分化之间的平衡保证雄性生命过程中精子发生的持续进行，一旦该平衡被打破则可能导致精子发生的障碍:过度增殖导致生殖细胞肿瘤，而过度分化则会导致雄性不育。
　　 睾丸支持细胞(Sertoli cell，SCs)位于睾丸生精小管内皮，由德国组织学家Enrico Sertoli于1865年发现并描述，它为SSCs提供非常关键的支持和营养作用。Sertoli细胞产生的胶质细胞源性神经营养因子(Glial cell-linederived neurotrphic factor，GDNF)是一种调控SSCs自我更新最关键的细胞因子，而干细胞因子(SCF)、骨形态发生蛋白4(BMP4)是由Sertoli细胞分泌的、能够调控SSCs分化的关键因子。目前已有证据表明，LPS可以使SCs的多种细胞因子表达发生变化，但尚未有人研究LPS处理SCs对SSCs的影响及其机制。
　　 本研究通过体外培养小鼠SCs和SSCs，利用免疫荧光染色和RT-PCR实验，探讨了LPS处理SCs对小鼠SSCs分化和自我更新的影响，并进一步利用RT-PCR和Western blot实验探讨了造成该影响的原因。进一步阐明了LPS导致的睾丸炎所致的不育的发生的机制，为男性不育症的治疗提供了新的实验依据。
　　 研究方法:
　　 1.SCs的体外培养和分组处理取5～6周龄昆明小白鼠睾丸组织，采用两步酶法消化，差异贴壁法纯化小鼠睾丸SCs，将细胞分为4组，分别是:正常对照组（Con组）、添加LPS处理1d组（1d组）、处理2d组（2d组）、处理3d组（3d组），LPS在培养液中的终浓度均为10μ g/mL。处理后去除含LPS的培养液并加入不含LPS的新鲜SSCs培养液继续培养48h，收集4组培养液作为条件培养液，分别与无GDNF新鲜SSCs培养液1∶1混合后待用;同时收集各组细胞保存备用。
　　 2.SSCs的体外培养和分组处理取5～7日龄昆明小乳鼠睾丸组织，按两步酶法消化，差异贴壁法纯化小鼠睾丸SSCs，将细胞分为4组，分别是:Con组、Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组，分别用前面制备待用的4组培养液培养96h，收集各组细胞，通过免疫荧光染色和RT-PCR检测细胞中PLZF、oct4、PCNA和c-kit、sohlh2基因的表达变化，并通过RT-PCR检测SSCs中Bcl6b、Etv5基因的表达变化。
　　 3.RT-PCR检测各组SCs GDNF、SCF、BMP4表达的变化，western blot检测各组SCs GDNF表达的变化。
　　 结果:
　　 1.SSCs免疫荧光染色结果显示，PLZF与PCNA的表达按照Con组、Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组的顺序递减，Con组最高，Ⅲ组最低，各处理组与Con组的差异有统计学意义（P＜0.01）。c-kit和sohlh2的表达按照Con组、Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组的顺序递增，Con组最低，Ⅲ组最高，各处理组与Con组的差异有统计学意义(P＜0.01)。
　　 2.SSCs RT-PCR结果显示，PLZF、oct4基因的mRNA水平按照Con组、Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组顺序降低，各处理组与Con组之间的差异有统计学意义(P＜0.01);而c-kit和sohlh2基因的mRNA水平按照Con组、Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组的顺序升高，处理组与Con组之间的差异有统计学意义(P＜0.01)。
　　 3.SSCs RT-PCR结果显示，Bcl6b、Etv5基因的mRNA水平按照Con组、Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组的顺序降低，各处理组与Con组之间的差异有统计学意义(P＜0.01)。
　　 4.SCs RT-PCR结果显示， GDNF的表达按照Con组、1d组、2d组和3d组的顺序降低，各组与Con组之间的差异有统计学意义(P＜0.01)。各处理组SCF、Bmp4的表达与Con组之间的差异则无统计学意义（P＞0.05）。
　　 5.SCs Western blot结果显示， GDNF蛋白水平按照Con组、1d组、2d组和3d组的顺序而降低，各处理组与Con之间的差异有统计学意义(P＜0.01，)。
　　 结论:
　　 1.LPS处理小鼠SCs能加速小鼠SSCs的分化，抑制其自我更新;
　　 2.LPS可导致小鼠SCs的GDNF表达减少，该变化通过下调小鼠SSCs内Bcl6b和Etv5基因的表达来促进其分化。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

材料与方法

一 实验材料

二 实验方法

实验结果

1．免疫荧光化学染色检测各组SSCs自我更新和分化标记物的表达

2．RT-PCR检测各组SSCs自我更新和分化标记物mRNA的变化

3．各组SSCs中受GDNF调节的自我更新必需因子表达变化

4．RT-PCR检测各组SCs GDNF、SCF、Bmp4 mRNA的变化

5．Western blot检测各组SCs GDNF蛋白的变化

讨论

实验结论

附图表

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文