大鼠睾丸组织支持细胞/生殖细胞长期共培养的精子发生分析及猪精原干细胞的体外初步研究

摘要

虽然对精子发生过程的研究取得了很多进展，但是体内体外研究模型的缺乏导致依然有众多问题未得到解决。哺乳动物的精子发生是通过复杂的增殖分化过程最终产生精子。睾丸发育、成熟与精子发生的研究受限于模式动物，对大型家畜和人的研究很少。睾丸体外生殖模型的发展为体外研究睾丸的精子发生分子机制和睾丸毒理学提供实验工具。但是，很多已建立的模型都无法真正模拟体内的复杂的生化分子及功能性相互作用，从而导致其研究价值有限。
　　 精子发生过程发生在生精上皮，包含三个过程。第一.精原干细胞(Spermatogonialstemcells，SSCs)通过有丝分裂增殖更新保持着SSCs数目恒定以及进一步分化为下游SSCs。下游SSCs继续更新发育为B型SSCs。第二.B型SSCs形成前细线型初级精母细胞。形成DNA联会复合体后，前细线型初级精母细胞进一步完成减数分裂形成2个次级精母细胞，最后形成圆形精子细胞。第三.圆形精子细胞完成变态过程，成为长形精子。
　　 综上，精子发生的基础是SSCs。SSCs因为在睾丸中的数目很少且很难分离纯化导致研究SSCs的增殖更新分化很困难。虽然在体内通过形态学可以鉴定和定位SSCs，然而这个方法不能用于鉴定体外分离纯化的SSCs。因此，建立一个完善的体外SSCs培养鉴定体系对于研究SSCs的增殖更新十分关键。
　　 1.大鼠睾丸曲细精管组织支持细胞/生殖细胞长期共培养与精子发生分析
　　 本实验已经建立了大鼠睾丸曲细精管组织支持细胞/生殖细胞长期共培养体系。采用大鼠睾丸组织块培养法，将15日龄的大鼠睾丸组织，用含10％标准胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养液进行培养。体系中的支持细胞和生殖细胞均由曲细精管组织块迁移到培养皿上，在不添加任何生长因子的情况下维持体外精子发生至圆形精子细胞超过2.5个月。在培养1-2周时，可观察到从曲细精管中游离出的支持细胞贴壁生长；生殖细胞在支持细胞附近贴壁生长。从共培养两周开始，体系中能一直观察到各级精母细胞和精子细胞，说明体系中存在有精原干细胞不断地进行减数分裂分化为精母细胞和精子细胞。
　　 2.大鼠睾丸曲细精管组织支持细胞/生殖细胞长期共培养中各类细胞的鉴定
　　 本实验建立了一个体外支持细胞/生殖细胞共培养体系。RT-PCR分析显示共培养细胞稳定表达cdh1、scp3、tnp2，免疫荧光染色结果显示CDH1、PLZF、SCP3以及SOX9阳性细胞存在。这些结果例证了体系中同时存在精原干细胞、精母细胞、精子细胞和支持细胞。这一结果进一步弥补了形态学观察上的不足，表明了组织块和共生的支持细胞为生殖细胞的增殖和分化提供了营养因子和调节因子。实验中建立的体外共培养体系可用于雄性生殖分子机制研究和环境毒理学研究。
　　 3.猪精原干细胞的分离纯化及长期培养
　　 本实验以10周斯格猪为研究对象，利用两步酶消化法分离得到睾丸曲细精管细胞悬液，根据精原干细胞与体细胞及各级分化生精细胞的贴壁能力及对细胞外基质粘附力的不同，将猪精原干细胞进行差异贴壁纯化。统计表明：每2g猪睾丸大约可以得到SSCs数目为2×105个，且得到的SSCs具有很高的活力和增殖能力，是一种高效的猪SSCs分离纯化方法。
　　 实验还建立了猪SSCs体外长期培养系统，该系统以丝裂霉素处理的STO细胞为滋养层，使用了添加GDNF、bFGF、GFRαl及B-27的无血清培养液。在该培养体系中，猪SSCs连续培养超过6个月，传代超过20代，培养中均能保持葡萄串状的SSCs细胞克隆形态不变。而且可在体外任意培养时期进行冷冻保存，解冻后可迅速恢复生长。
　　 此外，本实验运用睾丸冰冻切片免疫荧光染色对斯格猪睾丸内SSCs的形态及定位进行了检测，并证实用于体外分离培养的猪精原干细胞鉴定的标记基因DBA、PGP9.5、OCT4和PLZF是可靠的猪SSCs的标记基因。通过这些标记基因对长期培养的猪SSCs进行蛋白水平的鉴定。经细胞免疫荧光分析，体外分离培养的猪SSCs同时表达DBA、PGP9.5、OCT4和PLZF这几个体内SSCs表达的标记基因蛋白质产物。为下一步猪SSCs的研究奠定基础。