DNA甲基化异常与多囊卵巢综合征的关系及机制研究

摘要

第一部分:多囊卵巢综合征候选基因甲基化水平的研究
　　背景:
　　早在1935年，美国妇科医生Stein与Leventhal便描述了闭经或月经稀发，不孕，多毛，肥胖和卵巢多囊性增大这一系列症状，并称为Stein-Leventhal综合征，也就是我们现在惯称的多囊卵巢综合征。随着现代医学的不断发展，我们对于这一古老疾病的认识不断更新，不断深入，现在我们已经认识到多囊卵巢综合征不仅仅是单纯的涉及育龄妇女的生殖内分泌疾病，多囊卵巢综合征还可对女性糖脂代谢、心血管、皮肤、骨骼、以及心理产生重大而深远的影响。多囊卵巢综合征是多病因发病，从青春期迁延至绝经期的，呈现高度异质性的，涉及多个系统的复杂性疾病，是令人谈之色变的贯穿女性一生的梦魇。
　　最新的流行病学调查显示，在我国妇女中，多囊卵巢综合征的患病率高达5.6％(4)。攻克多囊卵巢综合征难题具有深远的意义，然而，要想彻底攻克多囊卵巢综合征诊断治疗方面的诸多难题，从根本上解密多囊卵巢综合征的发病机制刻不容缓。现今，多囊卵巢综合征的病因主要分为遗传和非遗传两个方面。在遗传方面，我们研究组通过前期全基因组关联分析的方法确定了多个多囊卵巢综合征易感基因，然而在非遗传方面，研究尚少有涉及，特别是多囊卵巢综合征的表观遗传学研究正越来越多的引起人们的重视。在哺乳动物中，表观遗传学信息可以表现为多种形式，DNA的甲基化是最早被人们所认识也是研究最多的方向。正常细胞功能的行使有赖于表观遗传的稳态的维持，而已有大量研究表明表观遗传的稳态的打乱是与多种疾病的发病相关的，其中就包括多种复杂疾病以及癌症。甲基化是表观遗传学中为人们认识最早也是了解的最清楚地现象。本部分研究便是从这些候选基因出发，研究这些多囊卵巢综合征易感基因的甲基化水平在病患之中是否有变化。
　　目的:
　　我们通过筛选前期全基因组关联分析的结果，选取了THADA(thyroid adenoma associated),LHCGR(Luteinizing hormone/choriogonadotropin receptor)以及TOX3(Thymocyte selection-associated high mobility group box)3个多囊卵巢综合征候选基因。通过采集多囊卵巢综合征患者以及正常受试者的外周血DNA，以重亚硫酸测序的方法检测上述基因启动子区域的甲基化水平，以图找到多囊卵巢综合征中甲基化异常的候选基因。
　　方法:
　　我们收集了30例多囊卵巢综合征患者以及30例年龄匹配的正常受试者的外周血标本，提取基因组DNA后，重亚硫酸测序的方法检测上述基因启动子区域的甲基化水平，并进行统计学分析。
　　结果:
　　在多囊卵巢综合征标本的LHCGR基因启动子区域的各个CpG位点的甲基化水平普遍呈较低的水平，虽然整体甲基化水平的差异并未达到统计学水平，单个位点的甲基化水平的分析显示，-141位点和+17位点的低甲基化的显著程度达到了统计学水平(CpG-141:10.89％Vs.18.31％,P=0.023;CpG+17:2.02％Vs.8.45％,P=0.002)，经过FDR法的校正后+17位点的低甲基化程度仍达到了统计学水平。其他两个基因，TOX3和THADA，它们的启动子区域呈普遍的去甲基化状态，多囊卵巢综合征病人与非多囊卵巢综合征病人之间并无区别。
　　结论:
　　通过筛选多囊卵巢综合征候选基因的甲基化水平，我们发现了多囊卵巢综合征患者中LHCGR这一在生殖调节上有重要作用的基因的甲基化水平的异常，为多囊卵巢综合征表观遗传学发病机制提供了证据，为进一步确证LHCGR甲基化水平的异常以及探求其中机理奠定了基础。
　　第二部分:LHCGR基因启动子区域甲基化水平与多囊卵巢综合征的关系
　　背景:
　　在第一部分的研究中，我们筛查了多个多囊卵巢综合征候选基因启动子区域的甲基化水平，其中，我们发现了在多囊卵巢综合征患者外周血DNA中的LHCGR基因启动子区域甲基化程度偏低的现象。LHCGR是黄体生成素以及绒毛膜促性腺激素的受体，是一种主要在卵巢以及睾丸表达的跨膜G蛋白偶联受体，LHCGR的活化在人类生殖过程中的激素功能有着至关重要的作用。在人类卵巢中，LHCGR在颗粒细胞、卵泡膜细胞、黄体细胞以及间质细胞中表达，在卵泡发育和甾体激素的合成等重要生物学事件有着举足轻重的地位。更巧合的是，在由DHEAs诱导的PCOS小鼠模型的卵巢组织中，人们亦发现了LHCGR去甲基化的现象。既往文献显示，LHCGR的转录活性的调节主要受到其启动子区域CpG位点甲基化水平的影响。因为同一位点的甲基化的水平在不同组织和细胞类型中是不同的，为了验证这个假说，仅仅得到外周血中的数据是不足够的，因此，我们又以体外受精一胚胎移植(IVF-ET)过程中得到的颗粒细胞为对象，检测了其中LHCGR基因启动子区域甲基化程度。颗粒细胞中异常的LHCGR甲基化水平或许通过影响LHCGR的转录在多囊卵巢综合征的发病中起作用。另一方面，业已证明妇女中LHCGR的基因突变可能导致高雄激素血症的表型，因此LHCGR的编码序列和非翻译序列有待于进一步测序以排除可能的突变的存在。
　　目的:
　　由于在第一部分中，我们发现了多囊卵巢综合征患者外周血白细胞中LHCGR基因启动子区域甲基化程度降低的现象，为了验证不同的细胞类型中是否有类似的情况，我们采用IVF-ET过程中的不孕患者的颗粒细胞，检测了颗粒细胞中的LHCGR的甲基化情况，以验证LHCGR低甲基化是否存在于多种细胞中，并且检验异常的LHCGR甲基化水平是否影响LHCGR的转录，从而确定LHCGR甲基化在多囊卵巢综合征的发病中起作用。另一方面，多囊卵巢综合征妇女的LHCGR基因的编码序列、启动予以及非翻译区将被测序，以排除可能的遗传变异的存在。
　　方法:
　　我们通过密度梯度离心的方法收集IVF-ET过程中不孕患者卵泡液中的颗粒细胞，其中有12份样本来自多囊卵巢综合征患者，12份样本来自年龄匹配的正常受试者，提取DNA后，以重亚硫酸盐测序的方法，检测了颗粒细胞中LHCGR基因启动子区域的甲基化程度，并使用real time qPCR的方法检测了LHCGR的转录水平，且用western blotting的方法检测了LHCGR的表达水平。另一方面，我们首先以DNA测序的方法检测192名多囊卵巢综合征病人的LHCGR的编码序列、启动子以及非翻译区。
　　结果:
　　在接受辅助生殖技术治疗患者的颗粒细胞中的LHCGR基因启动子区域甲基化水平的检测中，重亚硫酸盐测序的结果显示多囊卵巢综合征患者的LHCGR基因启动子区域呈总体低甲基化状态(P=0.004)，其中CpG-174，-148，-61，-43，-8，+10，+17以及+20在多囊卵巢综合征患者中的甲基化程度明显降低(CpG-174:14.00％vs.19.41％,correctedP=0.048;CpG-148:9.60vs.15.19％,correctedP=0.048;CpG-61:5.60％vs.10.13％correctedP=0.048;CpG-43:5.60％vs.10.13％correctedP=0.048;CpG-8:9.60％vs.14.77％,correctedP=0.046;CpG+10:6.00％vs.10.13％correctedP=0.047;CpG+17:4.80％vs.10.13％correctedP=0.050;CpG+20:4.80％vs.10.13％,correctedP=0.050)。RealtimePCR以及westernblotting的结果显示多囊卵巢综合征患者颗粒细胞的LHCGR转录和翻译水平升高。另一方面，通过对192例多囊卵巢综合征病人的DNA测序并未发现新发突变，仅发现3个已知SNP(rs2293275,rs11125179和rs10176989)。
　　结论:
　　LHCGR基因作为多囊卵巢综合征的重要易感基因，其DNA序列在多囊卵巢综合征患者中并未发现变异。而通过多种方法多种细胞类型的检测，其基因启动子区域呈明显的低甲基化状态，并使得LHCGR转录升高，可能参与PCOS的发病过程。
　　第三部分:导致多囊卵巢综合征LHCGR基因甲基化水平紊乱因素的研究
　　背景:
　　通过前面两部分的研究，验证了多囊卵巢综合征LHCGR基因启动子区域甲基化水平紊乱在外周血以及颗粒细胞中的存在，且在颗粒细胞中，此种甲基化紊乱还是与LHCGR的表达变化的趋势相同。在这个部分中，我们将从多个方面探寻可能影响多囊卵巢综合征患者中LHCGR甲基化紊乱的可能因素。在常染色体非印记基因中也广泛存在等位基因特异性的甲基化现象，通常表现为SNP的基因型与邻近的CpG位点甲基化水平之间的关联。在本项研究中，我们研究LHCGR基因的原因是因为位于其内含子的rs13405728这一SNP在我们前期的GWAS研究中达到了基因组显著水平，在前面的研究中，受制于样本量和实验方法的限制，我们不能得出SNP与甲基化水平之间的关系，因此我们在本部分的研究中，继续扩大了样本量，将rs13405728以及rs4073366两个SNP的基因分型信息与启动子区域甲基化水平。另外一个方面，激素水平可能导致甲基化程度的变化。高雄激素血症是多囊卵巢综合征最基础的特征之一，高LH血症也是多囊卵巢综合征的一个特点，并被列为日本制订的多囊卵巢综合征诊断标准之一，这两大激素引起了我们的兴趣，在这一部分研究中，我们将体外培养21天小鼠的颗粒细胞，在培养液中加入不同浓度的睾酮和LH，以观察是否对LHCGR基因的甲基化以及表达水平有影响，以探讨多囊卵巢综合征患者激素水平的异常与LHCGR甲基化水平之间的关系。
　　目的:
　　本部分主要探讨两个可能导致甲基化水平异常的因素，首先我们将检验全基因组关联分析所得的易感位点rs13405728基因型与LHCGR启动子区域甲基化水平的关系，再以这部分数据为基础，对所有标本的LHCGR的5'非翻译区的rs4073366进行基因分型，再检验rs4073366分型结果与甲基化水平的关系。另一方面，我们还将检测两种多囊卵巢综合征特征性的激素水平异常对于LHCGR甲基化水平的影响。
　　方法:
　　我们首先利用前期全基因组关联分析的数据和标本，按照rs13405728的基因型挑选90份多囊卵巢综合征标本以及90份正常对照标本，使用焦磷酸测序的方法检测了这些多囊卵巢综合征和健康对照标本的LHCGR基因启动子区域甲基化水平，以分析rs13405728与甲基化水平之间的关系;用直接测序的方法对rs4073366进行基因分型，分析rs4073366是否影响甲基化水平。另一方面，我们还利用小鼠的颗粒细胞体外加药培养的方法，针对性的研究了睾酮以及LH对于LHCGR基因启动子区域甲基化水平。
　　结果:
　　在多囊卵巢综合征以及对照者标本中，基因型对于LHCGR启动子区域甲基化水平影响的趋势是相同的，AA基因型导致各个位点的甲基化程度较高，GG基因型则导致各个位点的甲基化程度较低，杂合的AG基因型的标本的则处于两种纯和基因型之间，如果将多囊卵巢综合征标本数据和对照数据混合后，这种区别依然存在，且这种区别是达到了统计学水平的(P＜0.05)。rs4073366则没有明显的对于LHCGR甲基化水平的影响。生理浓度的10-9M睾酮浓度的培养液组的LHCGR启动子区域则呈现较高的甲基化状态，高浓度的睾酮可导致去甲基化的发生。
　　结论:
　　rs13405728可以等位基因特异性的影响LHCGR的甲基化水平，而较高的睾酮水平将会导致LHCGR去甲基化的发生，我们在多囊卵巢综合征病人中发现的LHCGR甲基化水平的变化可能是这两个因素所导致的。
　　第四部分:多囊卵巢综合征外周血全基因组DNA甲基化水平研究
　　背景:
　　多囊卵巢综合征(PCOS)是育龄期妇女最为常见的生殖内分泌疾病，其发病率高达6-8％。然而多囊卵巢综合征的病理生理过程仍不为我们所知，在过去的十多年中，多囊卵巢综合征发病的遗传因素被广泛的研究。我们最近的基因组关联分析发现了多个多囊卵巢综合征的易感基因，然而这些易感基因的发现不足以解释多囊卵巢综合征的异质性与复杂性，现在的理论认为，遗传、表观遗传以及环境因素共同构成多囊卵巢综合征的发病因素。
　　正常细胞功能有赖于表观遗传组的稳态，现在越来越多的研究表明表观遗传组的紊乱与多种人类疾病相关，特别是癌症与复杂疾病。对于多囊卵巢综合征来说，人们越来越意识到这一领域的重要性，个别研究表明了多囊卵巢综合征的某些基因(LMNA，follistatin，AR)甲基化水平的紊乱，我们前期的研究也表明LHCGR基因甲基化异常与多囊卵巢综合征之间的关系。在既有的一项研究中，人们并未发现多囊卵巢综合征患者与匹配的对照之间外周血中总体甲基化水平的区别。综上，针对多囊卵巢综合征进行表观基因组水平的DNA甲基化的关联分析是十分有必要的。
　　目的:
　　在本部分研究中，我们将使用Illumina公司的Infinium Human Methylation 450 Beadchip来进行全基因组的DNA甲基化水平的分析，具体来说，将检测超过470，000个CpG位点，覆盖99％的RefSeq基因，通过实验，我们将评价外周血基因组甲基化水平与多囊卵巢综合征之间的关系。
　　方法:
　　我们收集了300名多囊卵巢综合征病人以及300名对照正常人的外周血，并提取DNA。将每100份多囊卵巢综合征或者正常对照标本分别等量混合为一份。然后再将这些DNA混合液进行重亚硫酸盐转化，后以Illumina Human Methylation 450 Bead Chip芯片进行全基因组的DNA甲基化水平检测。对于芯片结果，采用重亚硫酸盐测序的方法对个别位点(IGF1R，UGR2b17，TNFα)进行重复验证。根据芯片结果的Diffscore值确定差异位点。基因注释以及通路富集度的分析采用Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery(DAVID)实现。
　　结果:
　　Illumina Human Methylation 450 Bead Chip检测了超过450，000个位点，发现了375个差异化的甲基化CpG位点，其中110个呈现低甲基化，而265个位点呈现高甲基化水平，多数基因处于CpG岛(island)，岸(shore)或者架(shelf)上，375个位点覆盖于314个基因。
　　结论:
　　全基因的分析检测出多囊卵巢综合征患者DNA甲基化水平的广泛的变化，提示甲基化异常在多囊卵巢综合征发病中的重要作用。