CD4+T细胞亚群在肥胖、2型糖尿病及其并发症中的作用及机制研究

摘要

当前肥胖及2型糖尿病发病呈现爆炸式增长的趋势，并已成为世界性公共卫生问题。系统性慢性低度炎症为肥胖及2型糖尿病的共同特征。该病理状态已越来越多地被证实为肥胖、2型糖尿病的发病及伴随并发症风险的核心环节。然而慢性炎症上游的细胞和分子机制还未明朗。当前，代谢负荷-免疫失衡在肥胖及2型糖尿病中作用的研究逐渐得到重视。事实上，除了后面带来的一长列代谢疾病和并发症，肥胖还常常被报道显著增加很多自身免疫病及炎症性疾病的发病风险，如哮喘、风湿性疾病、炎症性肠病等。这些流行病学证据更强烈地暗示代谢营养负荷和免疫失衡、炎症状态之间的潜在联系。
　　在肥胖及2型糖尿病慢性炎症的基础研究中，人们最早发现的明显改变是脂肪组织中巨噬细胞的浸润及相关炎性细胞因子表达上升，因此，固有免疫系统一度是学者的关注热点。而直到最近人们才开始把研究焦点集中到固有免疫系统紊乱的上游。WuH及Kintscher等分别发现并证实了T细胞浸润先于巨噬细胞出现。继而Nishimura.S等进一步证实T细胞在脂肪组织炎症的起始阶段即已介入，并与该炎症介导的糖耐量受损和胰岛素抵抗进展变化相一致。以上均提示T细胞在肥胖及2型糖尿病慢性炎症的上游启动和维持过程中发挥重要的作用。其中，CD4+T淋巴细胞可分化为Th1、Th2、Th17、Treg以及最新发现的Th22等细胞亚群，其在协调免疫细胞相互作用、维持免疫稳态中起核心作用，又被称作辅助性T(Thelper，Th)细胞。近年临床免疫学进展表明，Th细胞亚群的失衡是引起免疫失衡并造成慢性炎症状态的关键。促炎性Th细胞亚群包括Th1、Th17等比例上调或功能亢进，而抗炎性的Th2、Treg等比例下降或功能受损是促发慢性炎症状态的直接扳机点。前人研究揭示肥胖及代谢综合征患者及动物模型中均存在着脂肪组织及外周血Treg比例的下调。然而随着证据的积累，人们发现单从Treg出发并不能很好的解释免疫失衡与肥胖及其相关代谢疾病的关系。与前人相左，vanderWeerdK等甚至报道了肥胖患者外周血Treg及Th2等抗炎细胞数目较正常对照增加。但是，他们的研究对象排除了肥胖伴发代谢异常的患者，仅观察到了少数单纯肥胖而无代谢异常（如胰岛素抵抗状态）患者的外周血。由于在自然人群中，肥胖往往伴随血糖、血脂等代谢异常，或合并高血压、心血管疾病等。但有相当一部分人群，肥胖但代谢特征正常，研究者将这种情况称为“良性肥胖”或“代谢健康肥胖”。因此，上述现象也有可能说明这种抗炎变化是肥胖发生后的一种代偿，更完善的研究设计是必须的。而肥胖伴发胰岛素抵抗乃至糖尿病患者中是否存在免疫平衡状态的失代偿，以及这种失代偿改变对肥胖向相关代谢疾病转归的作用的研究显得更为迫切。更重要地，除了数量上的平衡，肥胖及2型糖尿病患者中Treg细胞亚群及促炎性Th细胞亚群功能状态的改变需要被给予更多的重视。
　　糖尿病带来的最大的痛苦和负担即种种并发症，而心血管并发症更以高发病率、高致死率而排在各种并发症的前面。其中糖尿病与冠心病的关联性如此之大，以至于学者明确提出“糖尿病为冠心病的等危症”这一概念。由于慢性炎症已被证实为肥胖、2型糖尿病及其相关并发症尤其是心血管疾病发生发展的“共同土壤”。曾经有学者推测促炎性的Th细胞亚群改变和急性心梗、变异性心绞痛等的发生有一定关联，但是目前尚缺乏系统研究可以证实这些Th细胞亚群改变对心血管事件发生风险具有独立显著的贡献。特别地，糖尿病本身就有促炎性Th细胞水平上调的基线改变。系统研究糖尿病患者中这些异常过度反应的Th细胞的与各项临床指标包括并发症的关系，不仅为肥胖及2型糖尿病本身的发病机制提供新的视角，也将为代谢相关并发症如心血管疾病的发病机制及干预治疗的探讨带来新思路。
　　我们的前期探索综合提示Th22细胞很可能是肥胖及2型糖尿病中的一个重要参与者。作为Th细胞家庭的新成员，Th22细胞亚群因其主要效应细胞因子IL-22的受体主要分布在外周组织而非免疫细胞上，被认为是直接向周围组织传递炎性效应信号的关键细胞亚群。最新进展已揭示Th22及IL-22在多种炎症相关疾病中扮演重要角色。Th22的主要效应因子IL-22是IL-10细胞因子家族的重要成员，其通过与由IL-10β及IL-22Rα两个亚单位组成的异二聚体复合物受体结合而引发生物学效应。IL-22已成为慢性炎症性疾病的一个重要干预靶点。然而其具体效应却因为组织特异性或其它炎性因子环境的差异而截然不同。如在银屑病、类风湿性关节炎中IL-22表现为促炎和损伤效应，而在病毒性肝炎等疾病中其又能发挥对肝细胞的保护和促增殖作用。已有文献报道IL-22受体在胰岛中丰富表达。而与我们在2型糖尿病患者中的观察一致，也有研究发现Th22在以β细胞特异性免疫损伤和功能耗竭为特征的1型糖尿病中也是上调的。因此，本研究将基于前期临床发现进而首先探索Th22的主要效应细胞因子IL-22以及TNF-α对体外胰岛β细胞细胞活性及增殖能力的影响。
　　目的:
　　1.系统对比研究肥胖及2型糖尿病患者外周血Th1/Th2，Th17/Treg及Th22等辅助性T细胞亚群的数目及比例、相关细胞因子谱及其分化相关特异转录因子表达水平的变化，探讨各亚群比例与胰岛素抵抗及β细胞功能损伤两大核心病理过程的关系;进一步探讨患者Treg与Tresp细胞功能状态的改变;
　　2.研究各促炎性辅助T淋巴细胞亚群对2型糖尿病患者心血管并发症发病风险的贡献;
　　3.探索Th22细胞主要效应细胞因子IL-22和TNF-α对胰岛β细胞损伤和增殖的作用及其机制。
　　方法:
　　1.研究对象:目的1入选人群及分组包括A健康对照组(CTL)，B代谢健康肥胖组(BMI≥30kg/m2，MHO)，C2型糖尿病组(T2D)3组;目的2研究对象为伴或不伴冠心病的2型糖尿病患者;所有观察对象均经过严格入选及排除标准筛查。
　　2.受试者研究指标:
　　A.所有患者需完善病史采集、空腹胰岛素及超敏C反应蛋白测定以及入院三大常规及生化检验等各项临床指标的检查;
　　B.采用流式细胞技术检测外周血CD4+T细胞及Th1、Th2、Th17、Treg、Th22各细胞亚群的比例;
　　C.Flowcytomix或ELISA法测定受试者血浆相关细胞因子水平;
　　D.通过实时定量PCR测定外周血单个核细胞中转录因子及关键功能蛋白的mRNA表达水平;
　　E.免疫磁珠细胞分选法分选得到Treg和Tresp细胞，通过磁珠扩增法观察其活性与增殖能力，利用混合淋巴细胞反应实验分析Tresp的细胞毒性作用及Treg的抑制功能。
　　3.流行病学及统计学分析:采取病例对照研究设计，t检验、方差分析或秩和检验等比较各组指标有无差异;Person或Spearman检验及偏相关分析探索指标间相关性;采用logistic回归分析校正混杂变量计算优势比，分析各指标对疾病的贡献值;分类变量绘制R×C表卡方检验等计算各指标的疾病风险预测价值等。
　　4.IL-22效应通路的探讨:分别用TNF-α、IL-22及二者联合刺激INS-1细胞，采用CKK-8及LDH法联合检测INS-1细胞的损伤和增殖，Westernblot检测STAT-3通路活化水平（pSTAT-3/STAT-3比值）;利用siRNA干扰技术分别敲除IL-22Rα及下游STAT-3，探讨IL-22R-STAT-3通路在β细胞炎性损伤和增殖中的作用。
　　结果:
　　1.MHO及T2D外周血各促炎Th细胞亚群占总CD4+T细胞的比例均有不同程度的升高:
　　A.其中更以Th22细胞的水平改变为著，T2D患者的Th22上调与MHO患者相比仍有显著意义[CTLvsMHOvsT2D:(1.18±0.06％，n=28)vs(1.88±0.10％,n=30)vs(2.247±0.10％,n=89)，P＜0.0001)];
　　B.Th1比例在T2D患者(median，17.73％;range，4.652-42.52％)显著高于MHO组(median，15.23％;range，2.297-27.56％)（*P＜0.05）和健康对照(median，11.17％;range，4.724-25.70％)(*P＜0.0001)，而在MHO组的上调不具统计学显著性;
　　C.Th17比例在MHO(median，1.815％;range，1.10-3.21％)及T2D患者中(median，2.08％;range，0.48-5.25％)显著上升(*P＜0.0001)，而MHO与T2D两组之间无统计学差异
　　D.升高的各Th细胞亚群之间均存在正相关关系(*P＜0.001);
　　E.升高的Th22是肥胖发病的风险因素，同时也是MHO向T2D转归的风险因素（OR值分别为54.47，8.636）。
　　2.与细胞比例一致，患者血浆中各细胞亚群对应的炎性细胞因子存在不同水平的上调:
　　A.IL-22血浆浓度在T2D(median，47.56pg/ml;range，30.55-76.89pg/ml)明显高于健康对照组(median，36.33pg/ml;range，31.93-40.62pg/ml)乃至MHO患者(median,36.65pg/ml;range,29.52-55.70pg/ml)(*P＜0.0001)，而MHO与对照组相比差别不显著(P＞0.05).
　　B.IFN-γ水平在MHO(median,1.76pg/ml;range,0.33-4.10pg/ml)(*P＜0.0001)及T2D(median,1.08pg/ml;range,0.36-3.43pg/ml)(*P＜0.05)患者中均上调，而两组患者间差别不显著.
　　C.IL-17水平在T2D患者(median，3.84pg/ml;range，0.81-7.78pg/ml)明显高于CTLs(median，2.06pg/ml;range，0.81-3.04pg/ml)甚至MHO患者(median，1.91pg/ml;range，0.89-5.11pg/ml)(*P＜0.0001).肥胖与对照组之间差别不显著。
　　3.T2D及MHO患者PBMC中Th22特异性转录因子AHRmRNA显著上调(分别是健康对照的2.23和2.91倍(*P＜0.05)，而外周血中促进Th22方向极化的细胞因子TNF-α和IL-6水平均上调。升高的AHR表达水平和TNF-α、IL-6水平与Th22细胞的比例均呈显著正相关(*P＜0.05)。
　　4.T2D及MHO患者外周血Tresp细胞的体外增殖能力和细胞毒性作用显著增强，Treg体外抑制功能明显降低。
　　5.外周血Th1、Th17、Th22比例和绝对数目的上升均对T2D患者中冠心病发病的风险具有一定贡献:
　　A.糖尿病合并心血管并发症患者三种促炎Th细胞亚群比例及绝对值甚至比无心血管并发症的患者还要高（*P＜0.05）;升高的Th亚群水平与炎性标志物（同样也是心血管事件风险重要指标）C反应蛋白存在正相关关系，其中Th1和Th22的绝对值与比例与CRP水平的相关性具有显著统计学意义(相关系数分别为0.249，0.257和0.303，0.454;*P＜0.05)。
　　B.利用logistic回归分析校正年龄、性别、糖尿病病程等混杂因素后，Th1，Th17andTh22细胞比例对冠心病患病率的贡献仍有显著意义，其中Th22细胞比例（每上升1％）和绝对数（每μl外周血中增加1个）的增加带来的风险贡献值最为突出（OR分别为41364.708和1.159）(*P＜0.0001)。
　　C.通过Stepwiselogisticregression模型分析各Th亚群改变在所有冠心病危险因素中的重要性和独立性，Th22绝对数仅跟在CRP、LDL-C、胰岛素抵抗指数之后进入最终模型。
　　D.相关性分析表明Th1、Th17与Th22绝对数均与动脉粥样硬化预测指数(AIP)呈显著正相关（*P＜0.05），而仅Th22的比例与AIP的相关性有统计意义。进一步R×C表分类变量分析示T2D患者中Th1比例或Th22的绝对数目中度升高（超过中位数）即可分别带来4.451倍的冠心病患病风险，其各自阳性预测值和阴性预测值同为79.63％和56.36％。
　　6.体外实验示IL-22处理INS-1细胞具有刺激其增殖和凋亡的双重作用:
　　A.单纯IL-22刺激促进INS-1增殖，但对INS-1也有损伤作用;
　　B.单纯TNF-α刺激剂量对INS-1有剂量依赖的损伤作用;
　　C.TNF-α与IL-22合用时，在单独刺激效应剂量的半量时即可引起INS-1的显著损伤;
　　D.干扰IL-RI或STAT-3表达均可阻止IL-22的细胞损伤和促增殖作用。
　　结论:
　　1.MHO患者即出现了外周血促炎性Th细胞亚群比例的异常上调及功能亢进，而T2D患者该异常进一步加重;新发现的Th22细胞亚群很可能在外周胰岛素抵抗及β细胞功能损伤过程中均扮演了重要角色;而PBMC中Th22转录因子AHR基因的上调可能部分解释了Th22极化的，细胞因子TNF-α和IL-6的升高同样驱动患者外周血Th0向Th22极化;
　　2.除了Th1/Th2及Th17/Treg等比例平衡上的改变，肥胖及T2D患者Tresp细胞增殖能力显著亢进，而Treg细胞抑制功能则相对显著受损;
　　3.进一步异常升高的Th1、Th17和Th22均对T2D患者中心血管事件发生风险的增加具有显著贡献，该作用可能通过促进慢性炎症损伤而实现;而外周血Th22细胞的数目对冠心病的发生发展具有最显著的贡献，且其作用可能独立于CRP、血脂、胰岛素抵抗等已知风险因素;Th1亚群比例和Th22细胞数目对心血管事件可能具有潜在预测价值;
　　4.Th22细胞的主要效应细胞因子IL-22和TNF-α均对INS-1细胞具有杀伤作用，IL-22对INS-1同时具有促增殖作用，然而在与TNF-α联合作用时以细胞毒性作用为主导;IL-22对胰岛细胞的作用依赖于IL-22R1-STAT-3通路。