TLR5靶向同种移植物放射性实时监测及自噬在同种排斥中的调节机制

摘要

目的:
　　本论文分为三部分对TLR5与Autophagy在同种移植耐受的实时动态显像和分子调节机制进行了系统的深入研究。1、选择免疫抑制剂雷帕霉素诱导的小鼠同种移植模型，以TLR5为靶点，制备放射性核素131-I标记的抗TLR5单克隆抗体为分子显像剂，通过体内注射，对移植排斥模型进行动态对比监测，为无创性移植耐受后的移植物实时监测探索新的途径;2、在同种移植模型中，通过与非特异性显像剂18F-FDG和同种型IgG进行对比，评价TLR5作为特异性耐受显像剂在雷帕霉素使用后对移植物的显像价值;3、对比研究自噬在同种移植模型移植排斥过程中变化及意义，初步探讨其影响同种移植排斥的可能的分子机制。
　　第一部分靶向TLR5的放射性核素标记抗体对雷帕霉素治疗的同种移植物动态监测
　　方法：
　　1、小鼠同种移植模型的建立
　　以C57BL/6小鼠为供体，将其背部全厚度皮肤移植到受体BALB/c小鼠，建立同种移植排斥模型;分为对照组和雷帕霉素处理组，处理组在移植术后每日腹腔注射雷帕霉素1.5mg/Kg直至对照组移植皮肤完全被排斥，对照组术后每日腹腔注射等量的PBS(phosphate buffered saline)。
　　2、131I标记的放射性示踪剂的制备和体外结合实验
　　Iogogen法制备并纯化131I-anti TLR5 mAb。分别将131I-anti TLR5 mAb置于小鼠血清和生理盐水中，37℃水浴，0h，12h，24 h，48 h，72 h和96 h分别检测标记物体外稳定性。通过BALB/c小鼠脾细胞的单位点放射性配体与受体结合分析检测131I-anti TLR5 mAb的Kd Bmax和KI值。
　　3、131I-anti TLR5 mAb在同种移植模型中的体内生物学分布研究在移植术后第7天向2组实验小鼠尾静脉分别注射131I-anti TLR5 mAb（0.37MBq/只），在注射后1h，12h，24 h，48 h和72 h，分别各取5只小鼠，脱颈椎处死，收集血液、移植皮肤、对侧正常皮肤以及各个器官组织，称重，测量放射性，研究131I-anti TLR5 mAb在模型小鼠体内的生物学分布状况，并计算靶（移植皮肤）与非靶（对侧正常皮肤）放射性分布的比值。
　　结果：
　　1、131I-anti-TLR5 mAb标记率为96.9％，比活度为458.6 MBq/mg，并且有良好的免疫学活性，Kd值为3.672 nM，最大结合量Bmax为5.388μM，半抑制浓度(IC50)和抑制常数(Ki)分别为8.89 nM和40.38 nM。131I-anti-TLR5 mAb体外放置72 h，放射化学纯度大于90％。
　　2、体内生物学分布结果显示，雷帕霉素治疗组，注射131I-anti-TLR5 mAb1 h移植皮肤的％ID/g值达到最大值，为12.05±1.86，注射后72 h，T/NT值达到最大，为8.10±0.10;而131I-anti-TLR5 mAb虽然也在排斥对照组移植部位聚集，但是明显低于耐受组(p＜0.001)。TLR5阻断组全身组织器官放射性比活度明显降低，移植皮片部位％ID/g降低92％，表明移植部位的131I-anti-TLR5 mAb摄取是特异性的。
　　3、动态全身放射性自显影图像的结果与体内生物学分布相一致，显示在注射12h后，131I-anti-TLR5 mAb在雷帕霉素耐受组移植物部位明显浓聚且明显高于对照组，在72 h获得移植皮肤对比度最为清晰显像。移植部位放射性活度分别为26，448±904 DLU/mm2(雷帕霉素治疗组)，9176±576 DLU/mm2（移植排斥组）和3881.5±62.6 DLU/mm2（阻断组）(p＜0.05)。TLR5阻断组移植皮肤放射性浓聚图像几乎不可见。
　　4、131I-anti-TLR5 mAb在两组实验小鼠移植物皮肤部位的摄取与同一组织TLR5的表达呈明显正相关(r2=0.93，P＜0.0001)。
　　第二部分131I-anti TLR5 mAb/131I-IgG/18F-FDG在雷帕霉素治疗的同种移植模型中显像价值的评价
　　方法：
　　1、建立小鼠同种移植模型
　　以C57BL/6小鼠为供体，将其背部全厚度皮肤移植到受体BALB/c小鼠，建立同种移植排斥模型。将模型小鼠分为对照组和雷帕霉素治疗组;治疗组在移植术后每日腹腔注射雷帕霉素1.5 mg/Kg，直至对照组小鼠移植皮肤完全排斥，对照组术后每日腹腔注射等量的PBS。
　　2、131I标记的放射性示踪剂的制备和生物学活性检测
　　131I-anti TLR5 mAb制备及鉴定方法同第一部分;Iogogen法制备并纯化对照同种型示踪剂131I-IgG。分别将131I-IgG放入小鼠血清和生理盐水中，37℃水浴，0h，12h，24 h，48 h，72 h和96 h分别检测标记物体外稳定性。3、131I-anti TLR5 mAb、131I-IgG和18F-FDG在同种移植模型动态分子显像中的对比研究
　　结果：
　　1、131I-IgG标记率为96.2％，比活度为407.2 MBq/mg，在小鼠血清和生理盐水中测定的体外稳定性在72 h后均高于90％。
　　2、在注射131I-IgG12 h后显示其在雷帕霉素治疗组移植皮肤部位出现浓聚，但是其放射性活度明显低于131I-anti TLR5 mAb，表明131I-anti TLR5 mAb在移植皮肤部位浓聚是标记物与TLR5受体特异性结合的结果，而非同种型IgG Fc段的非特异性结合所致。
　　3、18F-FDG的高摄取图像仅出现在对照组，而雷帕霉素治疗组移植物对18F-FDG的摄取量很低，图像上几乎不可见。131I-anti-TLR5 mAb则在雷帕霉素治疗组持续高摄取。131I-anti-TLR5 mAb与18F-FDG最高T/NT比值分别为（7.68和1.16）(p＜0.001)。这表明131I-anti-TLR5 mAb对雷帕霉素应用后的移植物分子影像检测与非特异性显像剂相比有明显的优势。
　　第三部分同种移植排斥过程中自噬分子的表达及意义
　　方法：
　　1、建立小鼠同种移植模型和雷帕霉素治疗组模型方法见第一部分。
　　2、自噬水平以及自噬发生相关基因和蛋白在移植模型尽力过程中的表达变化在小鼠同种移植模型术后的第4天，第8天，第12天和第16天，脱椎处死小鼠，分别取移植皮肤和脾，提取总mRNA和总蛋白。利用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)检测移植皮肤和脾细胞中自噬相关基因Beclin1，ATG5的转录表达水平。Western blot技术检测移植皮肤和脾细胞中自噬相关蛋白Belcin1，ATG5和LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ表达检测自噬发生水平。
　　3、同种移植小鼠移植皮肤部位131I-anti-TLR5 mAb摄取与自噬发生水平的相关性分析
　　以同种移植排斥组和雷帕霉素治疗组小鼠移植皮肤部位免疫组织化学TLR5染色测得的TLR5表达量与相应自噬的水平做相关性分析。
　　结果：
　　1、实时荧光定量PCR结果显示在同种排斥组中，自噬相关基因Becln1和ATG5均从移植术后第8天起升高，在第12天达到高峰，在第16天下降。在雷帕霉素治疗组出现同样的趋势，从第8天起的表达明显高于同种移植组。而且两组移植皮肤部位的表达均明显高于脾细胞(p＜0.01)。
　　2、Western blot结果显示Beclin1和ATG5蛋白表达与其基因表达水平一致:Becln1和ATG5均从移植术后第8天起升高，第12天达到高峰，第16天下降。在同种移植组，自噬相关分子LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值（自噬发生水平）在雷帕霉素治疗组最高，而且在同种移植急性排斥反应较强时明显升高，在同种移植急性排斥反应减弱后随之降低(p＜0.01)，表明自噬与移植排斥反应呈明显相关。更重要的是我们发现自噬相关基因与蛋白的变化在移植皮肤部位的变化比在脾脏的变化更加显著。
　　3、自噬分子与TLR5表达相关性分析:同种移植排斥模型中，移植皮肤部位自噬发生水平与TLR5的表达成正相关(r2=0.79)。
　　结论：
　　1.制备了131I-anti-TLR5 mAb，经鉴定具有良好的特异性和生物学活性
　　2.体内生物学分布结果显示，在同种移植模型中，131I-anti-TLR5 mAb被移植皮肤部位高摄取，显著高于对侧正常皮肤;与同种移植模型相比，雷帕霉素治疗后移植皮肤部位对131I-anti-TLR5 mAb的摄取的T/NT值更高。全身磷屏放射自显影结果与体内生物学分布结果一致，在雷帕霉素应用后，131I-anti-TLR5 mAb对移植物清晰显像。
　　3.Anti-TLR5 mAb可显著阻断131I-anti-TLR5 mAb在移植皮肤部位的浓聚，证明131I-anti-TLR5 mAb在移植皮肤部位的特异性摄取，而不是非特异性的聚集。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分 靶向TLR5的放射性核素标记抗体对雷帕霉素治疗的同种移植物动态监测

序言

材料和方法

一、实验材料

二、实验仪器

三、实验方法

实验结果

一、131I-anti-TLR5 mAb制备和生物学活性鉴定

二、131I-anti-TLR5 mAb在同种异体移植模型中生物学分布

三、131I-anti-TLR5 mAb在同种异体移植模型中的动态磷屏自显影显像

四、TLR5在移植皮肤部位免疫组织化学染色

五、TLR5的表达与131I-anti-TLR5 mAb的放射性活度值的相关性分析

讨论

第二部分 131I-anti TLR5 mAb／131I-IgG／18F-FDG在雷帕霉素处理的同种移植模型中显像价值的评价

前言

材料和方法

一、实验材料

二、实验仪器

三、实验方法

实验结果

一、131I-anti-TLR5 mAb铜J备及鉴定同第一部分

二、131I-IgG制备和体外稳定性

三、131I-IgG在雷帕霉素治疗的同种移植模型中的体内生物学分布

四、131I-IgG在同种移植模型中的动态全身磷屏自显影显像分析

五、18F-FDG在同种移植模型中的动态全身磷屏自显影显像分析

六、动态全身磷屏自显影显像图像半定量分析

讨论

第三部分 同种移植排斥过程中自噬分子的表达及意义

前言

材料与方法

一、实验材料

二、实验仪器

三、实验方法

实验结果

一、荧光实时定量PCR测定模型小鼠移植皮肤和脾细胞自噬相关基因Beeclin1和Atg5的表达

二、荧光实时定量PCR测定模型小鼠移植皮肤和脾细胞自噬相关蛋白Beclin1、Atg5、LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的表达

三、同种移植排斥过程中移植皮肤部位TLR5的表达与自噬发生水平的相关性分析

讨论

全文小结

论文创新点

附图表

参考文献

致谢

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