木犀草素-7-0-葡萄糖苷对心肌细胞损伤的保护作用及机制研究

摘要

心血管疾病是严重威胁人类健康的重大疾病，具有高发病率、高致残率和高死亡率等特点，发病年龄有年轻化的趋势。心肌损伤类型包括局部缺血性损伤、缺血再灌注损伤、缺氧损伤、心肌肥大、缺氧/复氧损伤、氧化应激损伤、高磷血症引起的心肌损伤、癌症患者化疗药物引起的损伤等。其中，癌症治疗的化学疗法会导致短期或者长期的心脏血管的并发症。在癌症患者化学疗法诱导的心肌毒性的药物中，葸环类抗生素是主要的毒性药物，由此限制了它的临床应用。而心肌细胞的营养缺乏在临床上也是普遍发生的，它介导多种心脏局部缺血病理过程，比如冠心病和心力衰竭等，在此过程中会发生自噬的激活，最终心肌细胞存活或者死亡。从天然植物中寻找新型、高效的具有心肌保护作用的药物仍是药学研究的重点之一。
　　中药作用范围广，毒副作用少，能有效地清除氧自由基抗脂质过氧化作用和调节钙离子稳定，从而保护心肌细胞损伤。青兰属植物为多年生草本植物，广泛分布于我国西北地区。其地上全草所含总黄酮静脉滴注可以有效缓解犬急性心肌缺血，缩小急性心肌梗死面积，冠脉流量明显增加。为寻找对心肌细胞有保护作用的有效成分，开发利用该植物资源，我院天然药化教研室对该植物地上全草进行了系统的化学成分研究，通过对已提取的化合物进行的药理活性研究，发现木犀草素-7-O-葡萄糖苷(Luteolin-7-O-Glucoside，LUTG)对心肌损伤有一定保护作用。前期研究表明LUTG预处理对多柔比星诱导的心脏毒性有显著的保护作用，且对多柔比星的抗肿瘤活性没有影响。但其具体的对心肌保护的作用机制尚不明确。本课题主要通过体外实验，研究LUTG对多柔比星或饥饿诱导的心肌细胞损伤的保护作用，并探讨其作用机制，为开发具有我国自主知识产权的心血管药物奠定基础。
　　LUTG对多柔比星诱导的心肌细胞损伤的保护作用:细胞形态学检测结果显示，LUTG明显抑制多柔比星诱导的H9c2心肌细胞损伤;DAPI及吖啶橙染色结果显示，LUTG逆转多柔比星诱导的H9c2心肌细胞的凋亡;JC-1荧光探针检测结果显示，LUTG逆转多柔比星诱导的H9c2心肌细胞线粒体膜电势的去极化，逆转线粒体的损伤;Western blotting结果显示，多柔比星处理组p-PTEN的表达明显下降，p-Akt，p-ERK，p-mTOR，以及p-GSK-3β的表达明显增加;而预处理LUTG(20μM)，明显上调p-PTEN的表达，明显下调p-Akt，p-ERK，p-mTOR，以及p-GSK-3β的表达。
　　LUTG对饥饿诱导的心肌细胞损伤的保护作用:MTT检测结果显示，心肌细胞的活力随饥饿时间依赖性的降低，自噬抑制剂3-MA降低正常条件及饥饿条件下心肌细胞的活力。流式和Western blotting结果显示，饥饿会抑制心肌细胞的周期和细胞周期蛋白cyclinD1和p21的表达，并抑制p-Akt，p-mTOR的表达，而上调p-ERK的表达。LUTG预处理后，MTT结果显示，LUTG(5，10，20μM)明显保护饥饿诱导的心肌细胞的损伤，而自噬抑制剂3-MA可阻断LUTG对饥饿诱导的心肌细胞损伤的保护作用。Western blotting结果显示，LUTG可增强饥饿条件下心肌细胞的自噬，并下调p-ERK的表达。
　　LUTG对多柔比星或饥饿诱导的心肌细胞损伤都有明显的保护作用，可能通过调节Akt/mTOR及ERK信号通路而发挥心肌保护作用。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

1．心血管疾病的现状

2．心肌保护的研究进展

第一部分 木犀草素-7-0-葡萄糖苷对多柔比星诱导的心肌细胞损伤的保护作用研究

1．实验材料

1．1 化合物

1．2 细胞株

1．3 试剂

1．4 仪器设备

2．实验方法

2．1 细胞培养及冻存

2．2 LUTG对多柔比星诱导的心肌细胞损伤的影响

2．3 LUTG对心肌细胞凋亡的影响

2．4 LUT对线粒体膜电位的影响

2．5 Western blotting检测LUTG对相关蛋白表达的影响

2．6 数据分析

3．实验结果

3．1 LUTG对多柔比星诱导的H9c2心肌损伤的影响

3．2 LUTG对多柔比星诱导的H9c2心肌细胞的凋亡的影响

3．3 LUTG对多柔比星诱导的H9c2心肌细胞线粒体膜电势的去极化的影响

3．4 LUTG对PTEN、Akt和ERK蛋白表达的影响

4．讨论

第二部分 木犀草素-7-O-葡萄糖苷对饥饿诱导的心肌细胞损伤的保护作用研究

1．实验材料

1．1 化合物

1．2 细胞株

1．3 试剂

1．4 仪器设备

2．实验方法

2．1 细胞培养及冻存

2．2 细胞活力的影响

2．3 细胞周期的影响

2．4 LUTG对细胞内酸性磷酸酶活性的影响

2．5 Western blotting检测相关蛋白表达的影响

2．6 数据分析

3．实验结果

3．1 饥饿对心肌细胞的活力的影响

3．2 饥饿对心肌细胞的周期的影响

3．3 饥饿对心肌细胞自噬相关蛋白表达的影响

3．4 自噬抑制剂3-MA对正常及饥饿条件下心肌细胞的活力的影响

3．5 饥饿对Akt及ERK蛋白表达的影响

3．6 LUTG对饥饿诱导的心肌细胞的损伤的影响

3．7 LUTG对心肌细胞自噬的影响

3．8 LUTG对溶酶体降解程度的的影响

3．9 LUTG对Akt／mTOR和ERK蛋白表达的影响

4．讨论

总讨论

结论

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表的论文