Nrf2缺失加剧DOX引起的心脏毒性和心功能障碍

摘要

背景：抗癌药多柔比星（DOX，也称阿霉素）是治疗大部分癌症的有效药物。但是，由于它引起的剂量相关性急性和慢性心肌毒性极大地限制了化疗用量。DOX引起的心肌毒性是多因素的，包括自由基引起的线粒体损伤、DNA损伤、抑制DNA和蛋白合成以及心肌纤维变性，这多种因素导致心肌细胞的凋亡和/或坏死。不过，其中的具体病理生理机制仍不完全明确。这其中占主导地位的假说是，氧化应激是DOX诱发的心肌疾病的主要原因。但是，治疗DOX相关的心肌病，非选择性清除活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的抗氧化药物是无效的。所以，更有效的治疗手段需要针对氧化应激来源或者内源性抗氧化系统更加特异的靶点;但是，这类特异性靶点仍待进一步研究。NF-E2相关因子2(Nuclear factor erythroid-2 related factor2， Nrf2)是一类转录因子，它调控基础以及诱导的抗氧化基因和细胞保护性Ⅱ相解毒酶的表达。研究已经证明Nrf2在心功能衰竭和病理性重塑过程中，是氧化应激的负调控因子;同时，也有文献报道Nrf2在硫化氢介导的氧化应激引起的心功能衰竭中具有调节作用。因此，Nrf2可能是治疗心肌细胞损伤和心衰的药物靶点。有意思的是，最近有报道表明Nrf2能增加自噬清除因ROS而产生的毒性泛素化蛋白聚集体的能力，以此证明Nrf2能发挥激活有效自噬的调节作用。因此目前的研究，我们探讨了心脏中Nrf2主要通过氧化应激和自噬活性调节DOX诱发心肌疾病的作用。Nrf2功能的缺失会加重DOX引起的氧化应激、自噬活性缺陷以及心肌细胞坏死，从而引起心功能衰竭。这些结果说明Nrf2在DOX心肌疾病中是关键的负调控因子，从而为发现治疗DOX心肌疾病的新的治疗靶点提供理论依据。
　　目的：①探讨在心脏中Nrf2主要通过氧化应激和自噬活性调节DOX心肌疾病的作用。②Nrf2是DOX引起的心肌疾病中关键的负调控因子，从而发现了一类可能治疗DOX引起的心肌疾病的新的治疗靶点。
　　方法：⑴构建Nrf2敲除小鼠。⑵建立阿霉素心肌疾病模型。⑶超声检测阿霉素心肌疾病小鼠的心功能情况。⑷测定体内自噬流。⑸组织免疫学检测氧化应激标志物和Nrf2表达。⑹Evans蓝标记坏死心肌组织。⑺制备Nrf2过表达和敲除以及Atg5过表达腺病毒。⑻新生大鼠原代心肌细胞培养和腺病毒感染。⑼Western Blot检测蛋白表达。⑽实时定量PCR(Q-PCR)检测基因表达。⑾应用SPSS统计软件进行单因素方差分析，P＜0.05有统计学差异。
　　结果：①单次腹腔注射DOX(25 mg/kg)后，心脏中氧化应激在第1天开始出现并维持到第4天，呈时间依赖性。同时，心脏中会出现大量的心肌细胞坏死，以心肌细胞的胞浆空泡化和散在的Evan蓝染色为标志。此外，DOX刺激4天引起收缩期左心室后壁厚度(LVPW;s)减少、收缩期和舒张期的左心室容积和FS％降低。②正常心脏中，给予抑制自噬小体与溶酶体融合的氯喹(chloroquine，CQ)，会引起心肌中LC3-Ⅱ和p62蛋白的增加，自噬流(autophagic flux)出现，说明自噬活性是正常的。虽然DOX刺激后会引起小鼠心肌中LC3-Ⅱ和p62蛋白的增加，但给予CQ却对它们没有影响，说明DOX使自噬流受损。此外，DOX还会引起心脏中泛素化蛋白呈时间依赖性聚集。③DOX促进了心脏中Nrf2 mRNA水平的表达，呈时间依赖性。DOX刺激4天后，心肌中Nrf2蛋白水平的表达也是增加的，并引起了Nrf2的核转位。此外，DOX使Nrf2的下游抗氧化表达基因NQO1和HO-1 mRNA水平增加。④在心脏可溶性和不可溶性成分中，Nrf2缺失增加DOX上调的LC3-Ⅱ和p62蛋白，说明Nrf2负调控DOX损伤的自噬流。Nrf2缺失并不影响可溶性成分中DOX引起的泛素化蛋白聚集，但增加不可溶性成分中泛素化蛋白的聚集。⑤DOX毒性剂量为1μM时，LC3-Ⅱ的水平增加;但使用自噬小体与溶酶体融合的抑制剂BafA1刺激，并不进一步使DOX上调的LC3蛋白累积。此外，DOX(1μM)刺激使细胞中不可溶性成分中的泛素化蛋白聚集。Nrf2过表达上调而Nrf2敲掉下调LC3-Ⅱ的水平。DOX刺激后，Ad-Gfp对照的细胞中LC3-Ⅱ水平累积，而Ad-Nrf2感染的细胞没有变化。相反，DOX使Ad-scramble对照组和Ad-miNrf2感染的细胞中LC3-Ⅱ水平呈相等程度累积。Nrf2过表达显著抑制了DOX引起的泛素化蛋白聚集体蓄积;而Nrf2敲掉增加了基础和DOX引起的泛素化蛋白聚集体蓄积。
　　结论：⑴Nrf2可能是DOX引起的心肌疾病中内源性抑制因子。其中的机制可能是Nrf2能抑制DOX引起的氧化应激和自噬损伤。⑵在DOX引起的心脏毒性中，Nrf2通过调节氧化应激和自噬活性，能为在防止或减轻DOX引起的心脏毒性和心功能障碍中作为新的治疗靶点提供理论依据。

目录

声明

摘要

符号说明

1．前言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

5 结论

附图表

参考文献

文献综述 心血管疾病的Nrf2通路治疗靶点

致谢

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