光滑鳖甲热休克蛋白70基因及抗冻蛋白基因表达规律的初步研究

摘要

新疆荒漠地区属于典型的大陆干旱性气候，昼夜温差和季节温差非常大，常年干旱少雨。然而在新疆荒漠地区依旧分布着大量的昆虫，其中鞘翅目拟步甲属昆虫是新疆荒漠地区一种代表性昆虫，在长期的进化过程中，逐渐形成了适应新疆荒漠气候的独特机制，成功地在荒漠环境中生存和繁衍下来。荒漠地区的昆虫与环境的关系极为密切，因此它们对环境的适应能力和耐受能力就决定了它们种群的数量和分布范围。是研究高温、低温、干旱等逆境胁迫下生物体的适应以及耐受机制的理想实验材料。 热休克蛋白70和抗冻蛋白都是当今生命科学的研究热点。它们在抵抗逆境胁迫时起着非常重要的作用。本研究以分布于新疆荒漠环境中的拟步甲属昆虫光滑鳖甲为研究对象，研究hsp40、afp在不同胁迫条件下的表达规律，探讨HSP70和AFP在其对环境的适应性和耐受性上所起的作用。 1、光滑鳖甲热休克蛋白70基因的克隆及序列分析利用GenBank中发表昆虫热休克蛋白70基因，在它们的保守区段设计引物，通过PCR结合RACE扩增的方法，获得新疆荒漠昆虫光滑鳖甲热休克蛋白70基因，命名为APhsp70。测序结果表明，序列全长为2092 bp，包含一个完整的开放阅读框，长1962 bp。基因结构分析表明APhsp70不含内含子序列。由核酸序列推演出的蛋白质分子量为70 kDa，含653个氨基酸残基。氨基酸序列比对分析结果表明与其他物种的HSP70都有很高的同源性，其中与拟步甲科昆虫赤拟谷盗Tribolium castaneum的同源性最高，氨基酸一致性为94.18％。通过核酸以及蛋白序列的同源性分析，证明本研究成功的克隆了一个光滑鳖甲HSP70家族成员基因。 2、光滑鳖甲热休克蛋白70基因的表达规律研究运用Northern blot和半定量RT-PCR分子生物学实验技术，在转录水平上分析了光华鳖甲热休克蛋白70基因(Aphsp70)在低温和高温胁迫条件下的表达规律。半定量RT-PCR结果显示Aphsp70在正常情况下有少量的表达。当昆虫受到高温胁迫后，Aphsp70的表达明显增强。Northern blot结果表明在高温处理5分钟时就有Aphsp70的增量表达，在处理15分钟时Aphsp70的表达水平显著升高。在不同强度的低温胁迫时，Aphsp70的表达水平不同。4℃和-10℃刺激，Aphsp70的表达没有明显的变化，但是-5℃刺激可以激起Aphsp70的表达升高。这种特殊的表达方式说明HSP70在光滑鳖甲热损伤、冷损伤保护中起着极其重要的作用。 3、光滑鳖甲抗冻蛋白基因表达规律的研究本研究以克隆的光滑鳖甲抗冻蛋白基因(Apafp914)为研究对象，通过Southern blot技术证明光滑鳖甲抗冻蛋白基因家族的存在。光滑鳖甲基因组内有不同形式的抗冻蛋白基因4-7个。采用半定量RT-PCR技术，研究该基因在不同温度处理下的表达规律。半定量RT-PCR实验结果表明光滑鳖甲成虫在经历长时间冷驯化后，体内Apafp914基因的表达水平增高。计算处理组的半定量RT-PCR产物电泳图像的灰度值，T检验的结果显示在低温处理的第5天，昆虫体内Apafp914基因的表达水平与对照组相比差异显著。快速冷驯化实验结果显示，处理组与对照组昆虫体内Apafp914基因的表达水平没有明显的差异。说明抗冻蛋白基因的表达受季节性气温变化的影响，属于越冬冷驯化的范畴，主要应对间接冷伤害和结冰伤害。

目录

论文说明：英文缩略语

声明

摘要

第一部分文献综述

第二部分实验内容

引言

1材料及试剂

1.1试虫

1.2试剂

1.3主要实验仪器

2方法

2.1 PCR引物的设计

2.2光滑鳖甲基因组DNA的提取

2.3光滑鳖甲总RNA的提取

2.4 RT-PCR

2.5 PCR

2.6 5'-RACE反应和3'-RACE反应

2.7构建pMD18-Aphsp70(core)等测序载体

2.8序列同源性分析

2.9 Northern blot

2.10 Southern blot

2.11半定量RT-PCR

2.12不同温度处理光滑鳖甲

3结果

3.1 APhsp70基因的克隆与序列分析

3.2高温条件下APhsp70的表达情况

3.3低温条件下APhsp70的表达情况

3.4 Southern blot结果

3.5快速冷驯化结果

3.6长时间冷驯化结果

4讨论

参考文献

第三部分结论和展望

第四部分附录

致谢