内质网应激蛋白Xbp1在果蝇饥饿过程中的功能及其作用机制研究

摘要

内质网(endoplasmic reticulum，ER)存在于真核细胞内，是细胞内分泌和跨膜蛋白的合成、修饰加工及转运必须的细胞器。在特殊的环境条件下，当内质网腔内的未折叠或错误折叠蛋白超过内质网的负荷时，细胞就会发生内质网应激(ERstress)。内质网应激一旦发生，内质网膜上的感受分子将激活一系列被称为未折叠蛋白质反应(UPR，Unfolded Protein Response)的信号通路来帮助内质网增强蛋白质处理能力或降低目的蛋白的合成以缓解压力。IRE1-XBP1信号途径是UPR反应中最为保守的一条通路。本实验室前期的一些研究结果发现，饥饿条件下，小鼠肝脏中的IRE1-XBP1信号通路能够被激活，并通过影响过氧化物酶体增殖激活受体α(PPARα)的表达来调控饥饿引起的代谢反应。本文中将介绍，我们采用果蝇作为模式动物，在果蝇及其幼虫的能量储存和代谢器官脂肪体中进行相关实验，结果表明:内质网应激蛋白dXBP1通过诱导果蝇叉头框O型蛋白(dFOXO)的降解减少饥饿条件下对脂肪的消耗，并延长果蝇在饥饿条件下的寿命。我们的实验结果还证明内质网应激蛋白dXBP1对dFOXO的降解反应依赖于蛋白酶体而不是经典的受胰岛素信号途径的调控。这些研究成果提示:内质网应激可参与饥饿应答，调控饥饿条件下脂肪的动员。研究具有理论与实际意义。
　　目的:
　　研究内质网应激蛋白XBP1在果蝇饥饿过程中的功能及其作用机制。
　　方法:
　　1.将对照组、dXbp1敲除组、dXbp1s过表达组的果蝇和3龄幼虫分别予以正常喂食和饥饿处理（果蝇饥饿48小时，3龄幼虫饥饿8小时），处理结束后，取各组果蝇和幼虫的脂肪体组织进行尼尔红(Neil Red)染色，观察脂肪体中脂肪的含量。使用三酰基甘油检测试剂盒和糖原检测试剂盒检测饥饿48小时后果蝇体内的三酰基甘油水平和糖原水平。
　　2.将对照组、dXbp1敲除组、dXbp1s过表达组的果蝇（每组分5培养管，每管20只）予以持续饥饿处理，每12小时统计死亡果蝇数目，统计完毕后通过Graphpad软件中的log-rank功能分析果蝇的存活率曲线，对比死亡一半时的时间点探究各种基因型的果蝇对饥饿的耐受能力。
　　3.通过qPCR检测不同基因型果蝇在正常喂食和饥饿条件下与影响脂肪积累相关的基因(FoxO，Bmm，4ebp，InR，Fas，HSL)的mRNA水平变化，初步分析可能的机制。
　　4.通过对果蝇脂肪体细胞免疫荧光染色分析，以及使用蛋白免疫印迹(WesternBlotting)法检测外源表达不同基因的果蝇S2细胞的蛋白样品等技术手段进一步探究内质网应激蛋白XBP1调控果蝇饥饿应答的机制。
　　5.通过果蝇形态学观察，嵌合体表达染色等技术手段，探究dFoxO、dXbp1异常表达对果蝇脂滴的积累以及果蝇幼虫的发育过程的影响。
　　结果:
　　1.dXbp1敲低组果蝇和3龄幼虫在饥饿条件下的脂滴含量较之正常喂食组均显著降低。在三酰基甘油和糖原水平的检测实验中，饥饿条件下，dXbp1敲低组的果蝇的三酰基甘油的下调较之正常喂食条件下更加显著。
　　2.持续饥饿条件下果蝇存活率检测实验结果显示，dXbp1敲低组的果蝇在第4.5天时全部死亡，死亡一半的时间点(Half Life Time)与对照组果蝇相比，差异显著。dXbp1s过表达组的果蝇在饥饿条件下存活时间为9.5天，死亡一半的时间点与对照组相比显著升高。
　　3.qPCR结果显示，在饥饿条件下，果蝇体内dFoxO的mRNA水平在dXbp1敲低和dXbp1s过表达的情况下较之对照组均没有明显变化，但dFoxO下游基因的mRNA水平在上述情况下均差异显著，其中Bmm的mRNA水平在饥饿条件下，dXbp1敲低组较之对照组显著升高，与正常喂食条件下的显著下降明显不同。HSL的mRNA水平在饥饿和正常喂食条件下在dXbp1不同表达组间变化趋势大致相同。
　　4.果蝇脂肪体细胞的免疫荧光实验结果显示，与正常喂食组相比，饥饿条件下的果蝇脂肪体中的dFOXO蛋白在胞浆中的含量显著降低，在与dXBP1s同时过表达的情况下，dFOXO的含量显著降低。作为对照的mcd8没有发生明显变化。
　　5.蛋白免疫印记法检测蛋白水平变化实验结果显示:dFOXO蛋白水平随着dXBP1s表达水平升高而降低，呈明显的负相关趋势;真核生物蛋白质合成抑制剂放线菌酮(CHX)处理的时间相关性实验结果显示，经过CHX处理，dFOXO蛋白的稳定性较高，而dXBP1s的稳定性较低，同时存在的情况下，dXBP1s仍然能够使dFOXO蛋白水平显著降低;在无MG132处理的情况下，过表达dXBP1s使dFOXO蛋白水平显著降低，而使用MG132处理之后，dXBP1s和dFOXO同时过表达的样品中，dXBP1s的表达水平与无MG132处理的情况下无明显变化，但是，dFOXO的蛋白水平与无MG132处理组相比显著升高。在MG132处理的情况下，dXBP1s过表达导致的dFOXO降解作用不明显;Insulin处理果蝇S2细胞使dFOXO表达量有所升高，但与dXBP1s共转后，dFOXO的降解作用并没有发生明显变化;Insulin与MG132同时处理S2细胞的结果显示，Insulin处理对于dFOXO的降解作用没有明显影响。
　　6.dXbp1敲低导致果蝇脂肪体中脂滴含量显著减少，同时敲低dFoxO使脂滴含量显著恢复;在正常喂食以及饥饿条件下，dXbp1敲低所导致的三酰基甘油含量的减少均被dFoxO敲低所恢复;与对照组果蝇对比，Xbp1敲低组果蝇抵抗饥饿的能力明显下降这一表型在同时敲低dFoxO的果蝇中得到了一定程度的恢复，单独敲低dFoxO组的果蝇在饥饿条件下的存活能力则较之对照组果蝇有所提高。
　　7.与表达GFP的对照组果蝇相比，dFoxO过表达的果蝇翅膀中，较上方的一条纵向的短小横隔脉消失;同时过表达dXbp1s，消失的短小横隔脉重新出现。
　　8.dFoxO过表达的果蝇幼虫发育缓慢且无法发育成成虫，同时过表达dXbp1s和dFoxO的果蝇幼虫与对照组相比发育缓慢，但仍能发育为成虫;同样饲养条件下，15天时，dFoxO过表达组的幼虫几乎没有存活，同时过表达了dXbp1s组的果蝇幼虫数量较dFoxO过表达组显著增多。
　　9.与对照组以及过表达dXbp1s组对比，过表达dFoxO组果蝇脂肪体内的脂滴明显变小，同时过表达dXbp1s导致脂滴大小恢复。
　　结论:
　　1.饥饿状态下，内质网应激反应的激活能够参与到脂肪动员过程中，果蝇脂肪体内的内质网应激蛋白dXBP1s能够通过减少脂肪的过度消耗延长果蝇的存活时间。
　　2.果蝇脂肪体中的内质网应激蛋白dXBP1可能通过控制dFOXO蛋白的降解调控果蝇幼虫的脂肪动员继而影响果蝇幼虫的发育。
　　3.饥饿条件下，果蝇脂肪体内的内质网应激蛋白dXBP1对dFOXO蛋白负调控的机制是促进dFOXO蛋白的降解，且这种降解过程主要依赖于蛋白酶体而不是胰岛素途径。更具体的作用机制仍有待进一步研究。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

材料和方法

1、材料

2、方法

结果

1 内质网应激蛋白Xbp1在果蝇饥饿过程中的作用

2 dXBP1s导致dFOXO蛋白水平变化

3 沉默dFoxO能够使dXbp1敲低果蝇的表型得以恢复

4 dXbp1s过表达可使dFoxO异常表达所造成的部分表型得以恢复

讨论

结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文