植入期CS2暴露致孕鼠自噬水平变化及膳食补充NCG对妊娠结局的影响

摘要

二硫化碳（Carbon disulfide，CS2）是工业上用途广泛的有机溶剂，也是纺纱原材料之一的粘胶纤维的生产原料。我国是纺织大国，粘胶纤维的产量持续高速增长，生产过程中CS2易挥发到生产环境中，对纺织女工的健康产生危害。研究发现CS2可致作业女工性腺机能障碍，胚胎早期流产和子代出生缺陷，具有明显的生殖毒性。前期研究发现小鼠围植入期CS2暴露会导致胚胎植入数目明显减少，并且子宫内膜细胞出现氧化应激和DNA损伤的现象。而氧化应激和DNA损伤影响胚胎植入的具体机制尚不完全清楚。
　　胚胎的成功植入一方面需要母体子宫的容受性，另一方面有赖于胚胎正常的生长发育并获得着床能力，并且这两个过程需要保持时相一致性。近年来，细胞自噬在生殖过程中的作用成为关注重点。细胞自噬是一种保守的细胞内降解过程，在受精卵形成、植入前胚胎发育、胚胎植入和胎盘形成等多项生命过程中都有重要作用。自噬水平的变化可能会导致不良生殖结局的发生。多项研究发现，氧化应激和DNA损伤能够影响细胞自噬水平。CS2暴露导致的氧化应激和DNA损伤可能会引起孕鼠子宫和胚胎的细胞自噬水平异常，进而导致胚胎植入障碍。此外，研究发现精氨酸补充可以降低自噬水平，并且精氨酸能够调节细胞增殖。N-氨甲酰谷氨酸(NCG)作为精氨酸补充剂，常用于生殖干预研究。CS2暴露小鼠孕期膳食补充NCG可能通过改变自噬水平影响生殖结局。
　　研究发现小鼠围植入期CS2暴露致胚胎毒性作用的最敏感的时期是孕第四天(GD4)，因此本研究以GD4孕鼠暴露于CS2,建立CS2暴露致小鼠胚胎植入障碍模型，检测孕鼠子宫和胚胎组织自噬变化水平，探讨CS2暴露致胚胎植入障碍发生可能机制。并且对孕期小鼠进行NCG膳食补充，观察NCG补充后CS2暴露孕鼠的生殖结局以及细胞自噬改变情况，进一步验证细胞自噬变化在CS2所致胚胎植入障碍中的作用。
　　研究目的：
　　构建CS2致小鼠胚胎植入障碍模型，观察暴露于CS2后孕鼠母体毒性和胚胎毒性及胚胎植入障碍现象，检测孕鼠子宫组织和胚胎组织自噬水平，探讨细胞自噬在CS2致小鼠胚胎植入障碍中的作用。对孕期小鼠膳食补充NCG构建膳食补充NCG并CS2暴露小鼠模型，检测孕鼠子宫组织和胚胎组织自噬水平，观察胚胎植入情况，验证细胞自噬在CS2致小鼠胚胎植入障碍中的作用。从母胎自噬水平角度探索CS2所致胚胎植入障碍的可能机制，为深入理解CS2暴露致生殖损伤机制提供科学依据。
　　研究方法：
　　1.动物受孕及分组
　　SPF级性成熟ICR种小鼠适应性喂养一周，按照雌雄比1∶1合笼，次日晨8点检查阴栓，阴栓阳性记为孕1天（即GD1），并将其随机分到各个观察终点。每个观察终点含12只孕鼠，随机分配6只接受CS2暴露，另6只为溶剂对照。
　　2.暴露时间和方式
　　孕鼠于GD4接受腹腔注射一次CS2或者溶剂（CS2暴露剂量为631.4mg/kg;溶剂对照为橄榄油;注射容量为0.1ml/10g体重）。
　　膳食补充NCG实验中，孕鼠于GD1开始补充NCG直至观察终点，补充方式为膳食添加。膳食NCG剂量设计为0.1％(NCG重量占基础饲料的0.1％)，根据小鼠每日进食量6～10g可以估算出每日NCG摄取量约为6～10mg(NCG补充剂量为240～330mg/kg)。增补NCG孕鼠在GD4接受CS2一次暴露。
　　3.样本收集及子宫组织和胚胎组织自噬水平的测定
　　于各观察终点收集孕鼠宫胚，-80℃冰箱保存备用。于GD9观察终点经脱臼处死孕鼠，称取子宫、卵巢、肝、脾、肾、胚胎的重量，并记录胚胎植入的数目。
　　自噬水平的测定:运用ELISA和RT-PCR方法分别测定孕鼠宫胚组织中P62和BECN1蛋白含量和mRNA表达水平;运用RT-PCR方法测定孕鼠子宫组织和胚胎组织中P62、BECN1、ATG5及LC3B的mRNA含量。
　　4.统计分析方法
　　实验数据分析处理采用spss17.0软件，P＜0.05认为有统计学意义。若数据符合正态分布且方差齐，采用两组独立样本的t检验比较暴露组与对照组两组之间的差异;不符合正态分布的数据则采用两组独立样本的t'检验比较暴露组与对照组之间的差异。
　　研究结果：
　　1.CS2暴露后母体毒性和胚胎毒性
　　母体毒性:妊娠期间各组动物总体重增加量、净体重增加量、子宫系数、卵巢系数、肝脏系数、脾脏系数和肾脏系数之间差异无统计学意义（P＞0.05），提示CS2暴露所致母体毒性较小。
　　胚胎毒性:①与对照组相比，CS2暴露组宫胚窝重、宫胚窝重系数均小于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，提示植入期暴露CS2后小鼠胚胎发育受到影响。②与对照组相比，暴露组胚胎植入数目明显降低(42.41％)，差异有统计学意义(P＜0.05)，提示植入期暴露于CS2可以造成明显的胚胎植入障碍现象。
　　2.CS2暴露后孕鼠母胎界面自噬水平变化情况
　　植入期暴露于CS2后，在GD5观察终点孕鼠宫胚自噬水平较对照组有所下降。与对照组相比，CS2暴露孕鼠GD5观察终点宫胚组织P62蛋白表达水平增加38.64％(P＜0.01)，P62mRNA表达水平增加113％(P＜0.01)，BECN1mRNA表达水平下降24％(P＜0.01)。
　　3.CS2暴露对孕鼠子宫组织自噬相关基因蛋白和mRNA表达的影响
　　植入期暴露于CS2后，GD6和GD7观察终点孕鼠子宫组织自噬水平均有所降低。①GD6观察终点:与对照组相比，暴露组孕鼠GD6子宫组织P62mRNA表达水平增加20.59％（P＜0.01），BECN1mRNA表达水平下降33.91％(P＜0.01)，ATG5mRNA表达水平下降20.04％(P＜0.01)。②GD7观察终点:与对照组相比，暴露组孕鼠GD7子宫组织P62mRNA表达水平增加43.87％(P＜0.01)，BECN1mRNA表达水平下降62.08％(P＜0.01)，ATG5mRNA表达水平下降19.23％(P＜0.01)，LC3BmRNA表达水平下降17.34％(P＜0.01)。
　　4.CS2暴露对胚胎组织自噬相关基因mRNA表达的影响
　　植入期暴露于CS2后，GD6和GD7观察终点孕鼠胚胎组织自噬水平均有所升高。①GD6观察终点:与对照组相比，暴露组孕鼠GD6胚胎组织P62mRNA表达水平下降43.24％(P＜0.01)，BECN1mRNA表达水平增加68.73％(P＜0.01)，ATG5mRNA表达水平增加22.37％(P＜0.01)，LC3BmRNA表达水平增加19.26％（P＜0.05）。②GD7观察终点:与对照组相比，暴露组孕鼠GD7胚胎组织P62mRNA表达水平下降67.96％(P＜0.01)，BECN1 mRNA表达水平增加了67.36％(P＜0.01)。
　　5.NCG补充并CS2暴露的孕鼠母体毒性和胚胎毒性
　　母体毒性:暴露并NCG补充组孕鼠与对照组相比，总增重和净增重均有所增加(P＜0.01)，差异有统计学意义;暴露并NCG补充组孕鼠与暴露组相比，总增重和净增重也有所增加（P＜0.01）。暴露并NCG补充组孕鼠子宫系数小于对照组（P＜0.01），而与暴露组相比无差异(P＞0.05)。各组动物卵巢系数、肝脏系数、脾脏系数和肾脏系数之间无差异(P＞0.05)。
　　胚胎毒性:与对照组相比，暴露并NCG补充组胚胎植入数目、宫胚窝重、平均宫胚窝重和宫胚窝重系数均无明显变化(P＞0.05)。而与暴露组相比，暴露并NCG补充组胚胎植入数目增加130.89％(P＜0.01)，宫胚窝重、宫胚窝重系数也明显增加（P＜0.01）。与暴露组相比，暴露并NCG补充组的平均宫胚窝重无明显变化(P＞0.05)。
　　6.NCG补充并CS2暴露的孕鼠子宫组织自噬相关基因mRNA表达水平的影响
　　暴露并NCG补充组与暴露组相比，各观察终点自噬水平均发生改变。与暴露组相比，暴露并NCG补充组GD6孕鼠子宫组织P62mRNA表达水平下降24.37％（P＜0.01），ATG5mRNA表达水平下降59.16％（P＜0.01），BECN1mRNA表达水平暴露并NCG补充组与暴露组相比差异无统计学意义（P＞0.05）;GD7孕鼠子宫组织中P62mRNA表达水平下降16.33％(P＜0.01)，ATG5mRNA表达水平下降12.01％(P＜0.01)，BECN1mRNA表达水平较暴露组差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　7.NCG补充并CS2暴露对胚胎组织自噬相关基因mRNA表达水平的影响
　　与暴露组相比，暴露并NCG补充组孕鼠胚胎组织自噬水平在各观察终点均有所下降。暴露并NCG补充组GD6胚胎组织较暴露组胚胎组织BECN1mRNA表达水平下降96.75％(P＜0.01)，ATG5mRNA表达水平下降51.20％(P＜0.01)， P62mRNA表达水平差异无统计学意义(P＞0.05)。暴露并NCG补充组GD7胚胎组织中P62mRNA表达水平增加27.95％(P＜0.01)，BECN1mRNA表达水平下降25.70％（P＜0.05），ATG5mRAN表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　研究结论：
　　1.孕鼠胚胎植入期暴露于CS2可导致子宫组织自噬水平下降，胚胎组织自噬水平的增高。CS2暴露后孕鼠子宫和胚胎自噬水平的变化可能是CS2致胚胎植入障碍的机制之一。
　　2.胚胎植入期CS2暴露并增补NCG可缓解CS2暴露导致的胚胎植入障碍现象。
　　3.孕期补充NCG能明显改变CS2暴露孕鼠子宫和胚胎组织自噬水平，其中暴露并NCG补充组胚胎组织的自噬水平明显低于暴露组。孕期补充NCG后暴露于CS2孕鼠子宫和胚胎组织的自噬水平变化可能是NCG缓解C52暴露致植入障碍的重要原因。

目录

声明

摘要

缩写词与符号说明

前言

材料与方法

1．主要试剂和仪器

2．动物模型的建立

3．实验方法

4．统计学分析方法

结果

1．CS2暴露对孕鼠子宫及胚胎组织自噬水平变化的影响

2．膳食补充NCG对CS2暴露小鼠妊娠结局及孕鼠子宫及胚胎组织自噬水平的影响

讨论

1．CS2暴露对小鼠胚胎植入和胚胎发育的影响

2．CS2暴露对小鼠宫胚和子宫组织自噬水平的影响

3．CS2暴露对小鼠胚胎组织自噬水平的影响

4．NCG补充并CS2暴露对小鼠胚胎植入的影响

5．NCG补充并CS2暴露孕鼠子宫组织和胚胎组织自噬水平变化

结论

创新和不足

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表的学术论文