bFGF和BMP-2预处理对骨髓间充质干细胞干性维持与成骨分化潜能的差异影响

摘要

目的：
　　牙周再生一直是牙周领域的研究热点。骨髓间充质干细胞(bone morrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)是骨髓来源的多能干细胞，在组织工程领域应用广泛。碱性成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,bFGF)和骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein2,BMP-2)在骨再生及牙周组织再生领域的应用已得到广泛研究。然而BMMSCs会随着增殖传代逐渐失去干细胞特性。因此如何获得具有良好增殖能力和成骨分化潜能的干细胞是目前牙周组织工程领域研究的热点。本研究旨在探究通过bFGF和BMP-2分别预处理细胞的方法对BMMSCs增殖、成骨分化、干性维持方面的差异影响并探讨其机制。
　　方法：
　　1、分离培养Wistar大鼠的BMMSCs，流式细胞术检测BMMSCs表面CD34,CD44,CD45,CD90的表达情况。将培养至P3代的BMMSCs分为三组，分别用普通培养基、含20ng/ml bFGF的培养基和含100ng/ml BMP-2培养基培养3天，收集细胞（以下简称为对照组、bFGF预处理组及BMP-2预处理组）。然后在无bFGF或BMP-2作用的条件下继续培养细胞。
　　2、三组BMMSCs预处理后培养1,2,3,5天，采用CCK-8法检测三组BMMSCs的增殖活性。并采用流式细胞术检测细胞周期分布的变化。
　　3、三组BMMSCs经成骨诱导培养3,7,14天后采用ALP活性试剂盒检测细胞的ALP活性。成骨诱导液培养28天后，进行茜素红染色观察钙结节，同时进行定量检测。
　　4、采用流式细胞术检测三组BMMSCs表面CD90的表达情况。
　　结果：
　　1、流式细胞术结果显示BMMSCs表面CD90、CD44高表达，造血系干细胞表面标志抗原CD34、CD45低表达。
　　2、CCK8细胞增殖检测实验结果显示:bFGF和BMP-2预处理组细胞增殖活性显著高于对照组(p＜0.05)，并且bFGF预处理组BMMSCs的增殖活性较BMP-2预处理组增强(p＜0.05)。细胞周期检测结果显示:经bFGF预处理后处于分裂期（S期）的细胞数增多，而处于静止期（G0/G1期）的细胞数减少(p＜0.05)，而BMP-2预处理后BMMSCs的细胞周期分布（G0/G1期，S期，G2/M期）没有显著改变。
　　3、ALP活性检测结果显示:第3天时，BMP-2预处理组BMMSCs ALP活性高于对照组和bFGF预处理组(p＜0.05)，第7天时，bFGF预处理组与BMP-2预处理组BMMSCs ALP活性达到最高峰且两组ALP活性差异无统计学意义(p＞0.05)，并显著高于对照组(p＜0.05)，而第14天时，bFGF预处理组细胞ALP活性显著高于对照组和BMP-2预处理组(p＜0.05)。成骨诱导培养28天后，钙结节茜素红染色及定量检测结果显示:三组细胞的钙结节形成情况没有明显差异(p＞0.05)。
　　4、bFGF预处理组CD90阳性细胞百分比高于对照组(p＜0.05)，BMP-2预处理组CD90阳性细胞百分比较对照组有下降趋势(p＞0.05)。
　　结论：
　　bFGF和BMP-2预处理均能够增强BMMSCs的增殖活性，bFGF对BMMSCs的促增殖作用可能通过调节细胞周期来实现;与BMP-2相比，bFGF更能有效维持BMMSCs的干细胞特性，且能保留其成骨分化潜能。

目录

声明

摘要

主要英文缩略语

前言

材料和方法

一、实验材料

二、实验方法

结果

1．BMMSCs形态观察、干细胞表面标志物的检测及bFGF、BMP-2预处理对BMMSCs形态的影响

2．bFGF、BMP-2预处理对BMMSCs增殖和细胞周期的影响

3．bFGF、BMP-2预处理对BMMSCs成骨分化潜能的影响

4．bFGF、BMP-2预处理对BMMSCs干细胞表面标志物CD90表达的影响

讨论

一、BMMSCs在牙周组织工程中的应用

二、BMP-2和bFGF在牙周组织工程中的应用

三、BMP-2和bFGF成骨促进作用的机制探讨

四、bFGF对BMMSCs干性维持作用的机制探讨

结论与展望

一、结论

二、展望

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的论文