褪黑素对甲基苯丙胺致行为敏化和神经毒性的干预作用及其机制研究

摘要

甲基苯丙胺(Methamphetamine，MA)是一种在全球范围内被广泛使用的精神兴奋药品，其滥用业已成为严重的社会问题。MA具有精神依赖性和神经毒性两个主要特点，其摄入后可短时间内改变人的行为和认知，并可诱发神经损伤。MA的长期滥用可导致患者注意力、工作记忆及决策能力的缺陷，并可促发精神疾病和攻击性行为，甚至造成显著的神经退行性改变。MA暴露后，患者普遍表现有严重的依赖性和很高的复吸率，这亦是其构成严重社会危害的主要原因。然而，尽管人们对于MA的危害已有充分的认识，截至目前，尚未发现针对MA成瘾和毒性的有效方法。因此，阐明MA依赖和毒性的机制以及寻求有效的干预药物对于MA成瘾患者的临床治疗至关重要。
　　药物依赖表现为不计后果的强迫性觅药和用药行为。当处于戒断期的个体重新暴露于与药物相关的环境时，将引发强烈的觅药渴望，从而导致复吸。药物戒断后，个体表现为持久的且不断增强的由药物相关暗示所引发的觅药渴望，这种现象被称为觅药渴望孵育(Incubation of Drug Craving)。其机制尚不明确。有观点认为，反复的药物刺激可导致神经回路产生对于药物激励作用的敏化，而对于动物来说，其主要的表现为行为敏化。作为药物渴求的一种表现，行为敏化与药物复吸密切相关。行为敏化是指在反复给予动物精神刺激性药物后出现的运动行为增加的现象。行为敏化可分为三个阶段:诱导期、孵育期和表达期，即在反复给予精神刺激药物注射（通常5-7天）后，进行7-14天的戒断孵育，再于最后一天注射药物，并记录行为变化。通常动物在经过一段时间的孵育后会出现运动剧烈增加的现象。目前，多数研究仅关注行为敏化的形成过程，尤其是最终敏化表达的变化，罕有文献论及行为敏化孵育期的影响，特别是经孵育过后这种运动大幅增加的内在机制。由于敏化孵育期亦是药物戒断期，而药物戒断将引发觅药渴求孵育，因此，敏化孵育与戒断孵育可能存在着共同的内在神经生物学机制。研究证实，药物戒断，尤其是MA的戒断，除觅药渴求外，还伴有焦虑和抑郁等症状。
　　MA戒断病人普遍存在着抑郁和焦虑症状，且这些症状和MA的觅药冲动以及复吸之间存在着显著的相关性。故此，有效对抗MA戒断后的并发症将可能起到缓解药物依赖的作用。大量研究证实，应激能增强药物渴求和复吸，而慢性应激将引发抑郁症。应激可激动下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴，诱发糖皮质激素的分泌，而这与MA暴露的效果类似。考虑到HPA轴与抑郁症的紧密关系，MA对于HPA轴的激动可能是MA戒断后容易引发抑郁症的一个内在原因。此外，应激、焦虑和抑郁均可抑制海马神经元新生，而海马神经元新生的增加能有效对抗应激和缓解抑郁症状，且各种抗抑郁治疗均可增加海马新生神经元的数目。研究表明，MA自给药可降低海马神经新生和增殖的能力，进而降低海马颗粒神经元的数量和海马体积。而MA暴露对于海马神经元新生的影响又与MA的神经毒性有关。
　　MA具有显著的神经毒性作用。MA暴露可导致不同脑区的灰质丢失、白质肥厚以及小胶质细胞增生。MA可诱发多巴胺能和五羟色胺能神经元末梢损伤，黑质纹状体通路损伤，增加患者罹患帕金森病的风险。普遍认为，MA的神经毒性和脑内多巴胺的急剧增加有关。多巴胺氧化后可产生活性氧簇(ROS)，促发氧化损伤，并被认为是MA具有神经毒性的主要原因。但后续研究发现，MA在无多巴胺环境下亦可引发神经损伤。故此，MA诱导的神经损伤应该还存在着多巴胺以外的机制。有研究表明，线粒体凋亡通路亦参与了MA的神经损伤过程。MA暴露可导致线粒体膜电位的降低和钙超载，从而诱发细胞凋亡。因此，具有抗氧化损伤和线粒体保护作用的药物，将可能起到对抗MA诱导的神经损伤的作用，而褪黑素就是其中之一。
　　褪黑素是一种由松果体分泌的“黑暗激素”。其具有诱导睡眠的作用并被成功地应用于睡眠相关疾病的治疗。褪黑素还是抑郁症的一种生物标记物，并可缓解小鼠由慢性应激诱发的抑郁样行为。此外，褪黑素确证具有抗氧化和清除自由基的作用。褪黑素可抑制特定脑区的多巴胺分泌，并参与调控与运动性疾病相关的多巴胺神经回路。而MA滥用将降低多巴胺转运体的水平，进而导致运动失常。有研究表明，褪黑素急性处理可减少MA导致的高热，但不能弱化MA诱发的行为敏化。高浓度褪黑素的急性处理能增强行为敏化，且于敏化表达前进行褪黑素的急性处理并不能发挥干预敏化表达的作用。而于敏化诱导期反复进行褪黑素急性干预，能够降低敏化表达。然而，尚未有文献采用在敏化孵育期进行慢性褪黑素干预，且褪黑素干预敏化的机制亦鲜有论及。另外，在体和离体实验均表明褪黑素可对抗MA诱导的神经损伤。由此，课题选用褪黑素对敏化孵育期进行干预，以期达到最终抑制敏化表达的效果。此外，在体外实验中我们又研究了褪黑素对抗MA神经损伤的作用及其分子机制。
　　目前，药物依赖的表观遗传学机制日趋为研究者所关注，而作为表观遗传的一部分，microRNA与药物成瘾的关系已有大量的文献报道。作为一种在脑内高表达和受pCREB调控的microRNA，miR-132对于神经系统的突触可塑性具有显著影响。miR-132能够靶向调控MeCP2的表达，而MeCP2对于神经元突触功能的维持意义重大。研究表明，可卡因强迫性摄取和安非他命诱发的行为敏化均与MeCP2有关。且MeCP2可调节BDNF的表达，而后者已明确参与药物成瘾进程。另据报道，BDNF可对抗MA诱导的神经元死亡，且此过程必须有AKT的参与调控。同样基于原代培养神经元的研究表明，BDNF的暴露可显著增加miR-132的表达。有趣的是，miR-132能促进神经元突起生长，而AKT作为一种促细胞存活因子，亦参与调节神经元突起的生长过程。此外，miR-132可靶向下调PTEN的表达，而PTEN可抑制AKT的磷酸化。由此，miR-132可通过抑制PTEN，间接激活AKT信号通路。而AKT可激活包括GSK3β和mTOR在内的大量下游分子。有研究证实，安非他命可去磷酸化AKT/GSK3β通路，并且MA暴露可降低mTOR的磷酸化。而褪黑素可通过磷酸化AKT/GSK3β通路对抗β-淀粉样蛋白诱发的神经损伤和激活mTOR发挥神经保护作用。
　　基于上述研究背景，本实验假设miR-132和MeCP2在前额叶以及伏隔核的表达将受到MA的影响，并与小鼠的行为敏化密切相关。而褪黑素对于敏化表达的干预作用亦可能与miR-132和MeCP2的表达水平相关。进而通过改变miR-132和MeCP2在NAc的表达可调节小鼠的敏化行为。关于神经毒性，我们对原代培养的神经元进行了MA损伤和褪黑素保护，并进一步探究了其分子机制。实验通过病毒转染原代培养的神经元过表达miR-132和干扰MeCP2的表达，以期可对抗MA诱导的神经损伤。实验还进一步研究了AKT/GSK3β/mTOR分子通路和MA诱导的神经损伤的关系。
　　第一部分褪黑素对甲基苯丙胺致行为敏化的干预作用及其机制
　　本部分实验，我们首先假设褪黑素在敏化孵育期的干预将缓解小鼠的MA戒断症状，并可对抗MA的神经损伤作用，从而最终导致行为敏化表达的弱化。小鼠行为敏化及褪黑素干预实验流程如下:3天的适应期过后，我们对小鼠进行连续7天的MA注射，诱导行为敏化的产生，并记录其活动距离;而后是14天的敏化孵育期，我们期间对小鼠进行连续的低剂量褪黑素处理;最后于第22天检测小鼠行为敏化的表达情况。我们发现敏化孵育期的褪黑素干预能降低行为敏化的表达。
　　基于以上结果，我们进一步探究了褪黑素对抗敏化表达的机制。考虑到褪黑素具有明确的抗抑郁作用，加之抑郁和焦虑为MA戒断后的主要并发症，我们推论褪黑素可能通过缓解敏化孵育期小鼠的戒断症状来发挥对抗敏化表达的作用。我们通过黑白箱实验、强迫游泳实验、新环境摄食抑制实验以及糖水偏好实验等反应小鼠焦虑和抑郁状况的实验证实:敏化孵育期的小鼠表现有明显的焦虑和抑郁，而褪黑素干预可显著缓解小鼠的焦虑和抑郁行为。此外，由于海马神经元的新生情况与MA戒断以及抑郁和焦虑症状关系密切，实验还进一步通过免疫荧光染色检测了Brdu以及DCX在海马的表达情况。结果发现，敏化孵育大幅降低了海马新生神经元的数目，而褪黑素干预可有效恢复海马新生神经元的水平。说明褪黑素干预可有效缓解小鼠在敏化孵育期的戒断症状，并可能由此发挥对抗敏化表达的作用。
　　为了进一步阐明MA诱导的敏化表达及褪黑素干预的分子机制，我们通过PCR、免疫荧光染色以及Western blot检测了miR-132和MeCP2在NAc和PFC的表达。结果发现敏化表达后，miR-132在PFC和NAc的表达均呈现为降低，而褪黑素干预可显著恢复miR-132在上述脑区的表达;同样的，免疫荧光染色和Western blot均显示，MA诱导的敏化表达可大幅增加MeCP2在NAc和PFC的表达，而褪黑素可有效降低MeCP2在上述脑区的表达。另据文献报道，pGSK3β与敏化的始动及表达均相关。我们发现MA相应地增加了pGSK3β在NAc的表达，而褪黑素可部分降低其表达（无统计学意义）。颇为意外的是，相关性分析显示，MA对照组及盐水对照组的MeCP2在NAc的表达与小鼠活动距离间存在着线性相关关系。基于以上发现，为了进一步明确miR-132和MeCP2在NAc的表达对于行为敏化的影响，我们进行了miR-132过表达以及MeCP2干扰载体的构建和慢病毒包装。我们于敏化孵育期的起始对NAc行慢病毒的双侧注射，分别上调miR-132和下调MeCP2的表达，并于敏化孵育过后检测其对最终敏化表达的影响。结果表明，下调MeCP2在NAc的表达可有效降低最终的敏化表达，而上调miR-132在NAc的表达可部分降低敏化的表达，但未取得有意义的结果。
　　总之，本部分实验表明，敏化孵育期的褪黑素干预可有效降低MA诱导的行为敏化的表达。此干预效果可能部分与褪黑素能够有效缓解MA戒断所导致的焦虑和抑郁有关。实验还进一步研究了miR-132/MeCP2分子通路在敏化表达及褪黑素干预过程中的作用。结果发现MeCP2在这一过程中发挥着关键性的调节作用。
　　第二部分褪黑素对甲基苯丙胺致神经毒性的干预作用及其机制
　　本部分实验，我们在体外研究了MA对神经元的损伤作用及褪黑素干预的机制。首先，我们自新生鼠取得皮层神经元并进行原代培养。在培养第5天对神经元进行不同浓度的MA损伤，通过CCK-8检测确定最佳损伤浓度。而后，我们在损伤的基础上，选用不同浓度的褪黑素对神经元进行保护，并确定最佳的保护浓度。基于以上结果，我们将实验分为三组，即对照组，MA损伤组以及MA损伤加褪黑素保护组。首先，我们通过Sholl分析检测了神经元突起的形态。结果表明，MA可显著减少初级突起的数量、树突分支的数量以及突起长度，而褪黑素干预可有效恢复初级突起的数量、树突分支的数量以及突起长度。然后，实验通过Hoechst/PI染色检测了凋亡和坏死情况。结果表明，MA暴露可大幅增加神经元的凋亡和坏死的数目，而褪黑素处理可显著对抗MA的损伤作用。
　　为了阐明MA诱导的神经损伤及褪黑素保护的分子机制，我们通过PCR检测了miR-132的表达变化。利用Western blot检测了pCREB、MeCP2和PTEN的表达变化。我们发现MA暴露显著降低了pCREB和miR-132的表达，而褪黑素可有效恢复二者的表达。而作为miR-132的下游靶基因，MeCP2和PTEN在MA暴露后均出现了表达增高，且褪黑素保护可显著降低二者的表达。我们利用慢病毒转染原代培养的神经元，过表达miR-132或下调MeCP2的表达。我们发现过表达miR-132可有效降低MeCP2和PTEN的表达，并且下调MeCP2的表达亦可导致PTEN表达的降低。而后，我们对转染过的神经元进行MA损伤。结果发现，过表达miR-132和下调MeCP2的表达均可有效对抗MA的损伤作用。我们还使用抑制剂下调了PTEN的表达，结果发现降低PTEN的表达亦有显著的保护作用。
　　考虑到miR-132/PTEN对下游AKT信号通路的影响，我们进一步研究了AKT/GSK3β/mTOR分子通路和MA诱导的神经损伤以及褪黑素保护的关系。首先，我们发现MA诱导的神经损伤可显著降低AKT/GSK3β/mTOR通路各分子的磷酸化水平。而褪黑素干预可有效增加AKT/GSK3β/mTOR通路各分子的磷酸化水平。在褪黑素保护的基础上，我们再通过LY294002和雷帕霉素分别抑制AKT和mTOR的磷酸化。结果发现，两种抑制剂均显著降低了褪黑素的保护效果。说明AKT/mTOR通路参与了褪黑素的保护作用。为进一步阐明GSK3β在MA诱导的神经损伤中的作用，我们选用氯化锂抑制GSK3β的表达（增加GSK3β的磷酸化水平）。结果发现氯化锂在磷酸化GSK3β的同时表现出显著的神经保护作用，并可进一步有效增加AKT和mTOR的磷酸化水平。且LY294002和雷帕霉素均可阻滞氯化锂的保护作用。说明氯化锂亦通过AKT/GSK3β/mTOR信号通路对抗MA的神经损伤作用。由此，本实验证实AKT/GSK3β/mTOR通路各分子的去磷酸化和磷酸化在MA诱导的神经损伤及干预过程中发挥着关键性的调节作用。
　　总之，本部分实验，我们通过MA损伤神经元和褪黑素二干二预，印证了褪黑素的神经保护作用。并进一步证实褪黑素可经由mi R-132/MeCP2/PTEN以及下游的AKT/GSK3β/mTOR分子通路对抗MA诱导的神经损伤作用。
　　结论：
　　本实验基于MA具有精神依赖性和神经毒性的特点，选用褪黑素作为干预药物，从在体和离体两个方面分别研究和阐述了褪黑素对抗MA诱导的行为敏化和神经损伤的机制。实验首次使用褪黑素对于敏化孵育期进行慢性干预，并有效地降低了MA诱导的行为敏化的表达。考虑到敏化孵育期亦是药物戒断期的特点，以及褪黑素对于抑郁和焦虑等戒断症状的明确作用，我们通过大量的行为学实验发现，褪黑素可有效缓解抑郁和焦虑等MA戒断症状，并推论这可能与褪黑素缓解敏化表达的作用相关。另外，在分子机制方面，我们发现，MA诱导的敏化表达可分别导致miR-132和MeCP2在PFC和NAc的降低和过表达，而褪黑素干预可显著增高miR-132的表达和有效降低MeCP2在上述脑区的表达。鉴于本实验发现MeCP2在NAc的表达与小鼠活动距离之间的线性相关关系，我们通过慢病毒干扰下调了MeCP2在NAc的表达，结果显著降低了敏化的最终表达。说明MeCP2在NAc的表达水平对于行为敏化的表达具有重要的调节作用。为了进一步阐明MA的神经毒性作用及褪黑素保护的机制，我们设计了体外实验。实验证实了褪黑素可有效对抗MA诱导的神经损伤作用。我们进一步发现褪黑素可通过miR-132/MeCP2/PTEN以及下游的AKT/GSK3β/mTOR分子通路对抗MA诱导的神经损伤作用。总之，本实验为阐明MA诱导的行为敏化及神经损伤的机制及褪黑素的干预治疗提供了新的线索。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

第一部分 褪黑素对甲基苯丙胺致行为敏化的干预作用及其机制

实验材料和方法

结果

讨论

第二部分 褪黑素对甲基苯丙胺致神经毒性的干预作用及其机制

实验材料和方法

结果

讨论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文

学位论文评阅及答辩情况表

英文论文