鱼类水霉病病原生物拮抗菌的筛选及其拮抗机理分析

摘要

水霉病为水产养殖中的常见病，危害较大。对于水霉病的防治尚无有效的化学药物，但利用生物之间的拮抗作用进行疾病防治，在渔业生产中已有应用。本研究拟分离获得水霉病原菌，进行种属鉴定；探讨其生长条件；以强致病性菌株作为指示菌，筛选水霉病原菌拮抗菌，进行种属鉴定；优化拮抗菌培养条件；探索拮抗机理，并对拮抗活性物质进行分离纯化，为鱼类水霉病的生物防治奠定基础。研究结果如下:
　　(1)从感染水霉病的罗非鱼病灶处分离得到一株水霉，经鉴定此水霉属于水霉科，水霉属，拟为水霉属中一新种，命名为SaprolegniaLF04；攻毒实验证明LF04对鲤鱼鱼卵的感染率为90％，对河魲鱼卵的感染率为52%；最适生长温度为25℃， pH为7.0，对无机盐比较敏感，2%的盐度能完全抑制其生长；
　　（2）以水霉病原菌LF04作为病原指示菌分离筛选出2株具有较强拮抗作用的拮抗菌：JL04和JL50；经形态学及分子生物学鉴定， JL04为枯草芽孢杆菌， JL50为短小芽孢杆菌。
　　（3）鱼体攻毒和水霉防治实验证明，两株拮抗菌对鱼体没有毒性，鱼体感染水霉的概率降低了45%（JL04）和38.4%(JL50)；传代实验证明，两株拮抗菌的拮抗特性都能稳定的遗传给后代；JL04的拮抗谱较JL50要广，JL50只对特定水霉菌株（LF04、LF01）有拮抗性，JL04菌株更能适应实际生产需要。
　　（4）拮抗菌拮抗机制分析发现JL04菌株发酵液对水霉菌丝的抑制率为70%，无细胞发酵液对水霉菌丝的抑制率为40%，均能抑制水霉孢子萌发，因此分析认为该拮抗菌是分泌拮抗物质至培养液中发挥作用；无细胞发酵液对温度、pH、蛋白酶K敏感，故分析认为拮抗物质性质为蛋白质；发酵液蛋白粗品经过分子筛层析和SDS-PAGE电泳检测，确定具有拮抗活性蛋白分子量大约为2.7*104Da。因此该拮抗菌的拮抗机制为分泌具有拮抗活性的蛋白质至胞外抑制水霉菌菌丝生长及孢子萌发。
　　（5）拮抗菌JL04发酵条件及培养基优化：发酵条件的研究结果表明菌株JL04对温度和pH较为敏感，其生长最适温度为32℃，最适pH在5.0-6.0之间，接种量对菌体生长的影响不显著；通过单因素实验和正交实验，初步得到了在实验室条件下的JL04菌株液体发酵的培养基优化配方：6 g/L胰蛋白胨，6 g/L葡萄糖，3.5g/L酵母提取物，3.5g/L硝酸铵，2g/L硫酸镁，3g/L氯化钙，1g/L硫酸锰。优化后的培养基，其生长到稳定期的时间缩短了2h，无细胞发酵液对菌丝的抑制率提高了12.5%。

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第一章 绪论

1 引言

2 鱼类水霉病及其防治

3 生物防治在水产养殖中的应用

4 拮抗菌的筛选方法

5 本论文研究的目的、意义和研究内容

第二章 水霉病病原菌的分离和鉴定

1 引言

2 实验仪器、材料及方法

3 结果

4 结论

第三章 水霉拮抗菌的筛选及鉴定

1 引言

2 实验仪器和材料

3 实验方法

4 结果

5 结论

第四章 拮抗菌安全性及拮抗特性

1 引言

2 实验仪器和材料

3 实验方法

4 结果

5 结论

第五章 JL04菌株拮抗机制初步研究及拮抗物质分离

1 引言

2 实验仪器及材料

3实验方法

4 结果

5 结论

第六章 拮抗菌JL04发酵条件优化

1 引言

2 实验仪器及材料

3 实验方法

4 结果

5 结论

第七章 结论与展望

1 结论

2 展望

参考文献

附录

致谢

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