TGF-β1介导TGF-β1/Smad及ERK/MAPK通路协同促进大鼠骨髓炎瘢痕形成的机制研究

摘要

第一章大鼠骨髓炎动物模型建立和评估的研究
　　研究背景
　　骨髓炎是是致病微生物感染骨及周围组织并引起骨破坏的急慢性炎性反应过程，按照感染来源可以分类为血源性骨髓炎、创伤性骨髓炎和临近组织感染性骨髓炎。创伤性骨髓炎是由外伤、手术等因素引起的骨感染，临床上治疗极为棘手，它的病理特点表现为病原菌持续存在、炎症反复刺激、周围组织瘢痕以及死骨形成，常常发展为慢性骨髓炎。由于其治疗时间长、治疗效果差，病程迁延不愈，有些病人最终面临截肢的后果，给病人和社会带来繁重的负担。临床上创伤性骨髓炎的病理生理过程复杂多变，因而建立一种稳定的创伤性骨髓炎动物模型，对理解骨髓炎的发生、发展过程并指导临床骨髓炎的预防及治疗，有着重要的意义。
　　多种动物可用于制作骨髓炎模型，大型动物具有耐受性好等优点，但是花费高，小型动物利于操作、花费低，但是耐受性差。应根据不同的实验目的选择不同的实验动物。骨髓炎动物模型的制作方法也不尽相同，有局部细菌注射、局部硬化剂注射、异物植入等方法，目前没有统一的骨髓炎动物模型制作标准。
　　研究目的
　　在文献及前期研究基础上，建立一种稳定的、能够模拟临床中创伤性骨髓炎发生机制的骨髓炎动物模型，并建立骨髓炎相关指标评价体系，为后续实验做准备。
　　研究方法
　　30只wistar大鼠分为两组，A组为空白对照组，B组为骨髓炎模型组。每组15只实验动物，分别于7，14，28天取材。根据取材时间A、B两组各分为3个亚组。其中A组实验动物切开皮肤肌肉显露一侧股骨后直接缝合，B组为骨髓炎模型组，动物模型制作具体操作如下:大鼠腹腔注射水合氯醛溶液腹腔麻醉生效后，下肢常规剃毛后固定四肢于木板，术区消毒、铺洞巾，采用股骨外侧入路，纵向切开皮肤、肌肉，显露一侧股骨中段，利用咬骨钳在股骨中段咬成小蝶形骨块，造成股骨干骨折，自股骨大转子顺骨髓腔钻入直径为1.0cm的克氏针固定股骨，将50ul浓度为106CFU/ml的金黄色葡萄球菌悬液注射于骨折断端，表面覆盖明胶海绵减少细菌悬液溢出，将游离蝶形骨折块回植，逐层缝合切口。术后观察两组实验动物7，14，28天的切口愈合情况;于术后7，14，28天分别拍摄股骨X线，观察骨折端软组织肿胀程度、骨膜反应及骨质改变;术后7，14，28天分别留取肌肉组织及骨骼组织标本，利用HE染色方法观察肌肉组织及骨骼组织细微结构的变化，利用细菌学方法培养骨骼组织观察细菌感染情况，培养出金黄色葡萄球菌为模型制作成功标准。
　　研究结果
　　对照组术后手术部位愈合良好，未见切口感染表现;骨髓炎组实验动物术后7天出现手术部位肿胀，术后14天手术部位少量脓液溢出，术后28天手术部位大量脓液、死骨排出。对照组术后X线骨质正常;骨髓炎组术后X线7天可见轻度骨膜反应，术后14天可见骨膜反应加重，部分骨痂形成，骨皮质变薄，髓腔变宽，术后28天可见感染征象，骨质破坏，呈虫蚀样改变，硬化骨形成，失去正常髓腔结构。对照组软组织HE染色未见感染及肉芽组织增生征象;骨髓炎组术后7天肌肉软组织HE染色见骨骼肌细胞坏死，大量中性粒细胞及单核细胞浸润，术后14天骨骼肌细胞稀疏、大量毛细血管增生，组织内成纤维细胞增生，术后28天组织内旋涡状肉芽组织增生，瘢痕形成表现。对照组术后骨质HE染色呈正常形态，骨皮质完整有序;骨髓炎组骨骼HE染色在术后7天可见骨皮质内炎细胞浸润，术后14天见骨皮质内骨质吸收，髓腔扩大，术后28天见炎细胞减少，骨质稀疏，骨皮质破坏较重。对照组骨骼组织细菌培养阴性，骨髓炎组术后7、14、28均培养出金黄色葡萄球菌。
　　研究结论
　　通过我们改良的方法，能模拟临床创伤性骨髓炎发生过程，制作出稳定的骨髓炎动物模型，为后续实验提供保障。
　　第二章 TGF-β1/Smad及ERK/MAPK信号通路的表达变化与大鼠骨髓炎周围软组织瘢痕形成之间的关系
　　研究背景
　　骨髓炎具有迁延不愈的特点，慢性炎症刺激可逐步影响到周围软组织，导致软组织瘢痕形成。一方面，骨髓炎周围软组织瘢痕的形成不利于血液循环微环境的建立，影响抗菌药物到达病灶发挥抗炎作用;另一方面，骨髓炎周围软组织瘢痕对肢体美观及功能也有影响。骨髓炎的治疗宜采用抗生素药物治疗与手术清除坏死感染组织相结合的方法，无论是手术治疗还是抗菌药物治疗，减轻局部瘢痕形成从而建立一个有血运的微环境对骨髓炎的治疗至关重要。TGF-β1是引起纤维化疾病的重要细胞因子之一，其介导的经典的TGF-β1/Smad信号通路以及非经典的ERK/MAPK信号通路在纤维化疾病形成中起重要作用，然而骨髓炎中瘢痕化机制是否与TGF-β1介导的TGF-β1/Smad及ERK/MAPK信号通路有关还未被阐明，研究骨髓炎中瘢痕形成机制对临床上骨髓炎的预防、治疗有重要意义。
　　研究目的
　　1.研究骨髓炎动物模型中软组织瘢痕形成的时间。
　　2.研究TGF-β1介导的TGF-β1/Smad信号通路以及ERK/MAPK信号通路的表达变化，与骨髓炎周围软组织瘢痕形成之间的关系。
　　研究方法
　　30只wistar大鼠分为两组，A组为空白对照组，B组为骨髓炎模型组。每组15只实验动物，分别于7，14，28天取材。根据取材时问A、B两组各分为A1-3以及B1-3个亚组。根据第一章模型制作方法，利用金黄色葡萄球菌制作大鼠骨髓炎动物模型。免疫组织化学染色检测软组织中TGF-β1表达变化，MASSON染色检测胶原沉积程度，Western blot检测TGF-β1/Smad信号通路、ERK/MAPK信号通路以及Ⅰ型胶原的表达变化。
　　研究结果
　　TGF-β1免疫组织化学染色显示，对照组中在1周、2周、4周时TGF-β1阳性表达分数分别为11.08％、13.86％、13.62％，骨髓炎组TGF-β1阳性表达分数在1周、2周、4周时分别为19.07％、56.35％、83.12％，骨髓炎组与对照组相比，1周时TGF-β1表达无显著性差异(P＞0.05)，2周及4周时TGF-β1表达水平增高，有显著性差异(P＜0.05); MASSON染色显示，对照组中在1周、2周、4周时胶原容积分数分别为0.19％、0.11％、0.85％，骨髓炎组胶原容积分数在1周、2周、4周时分别为1.37％、43.72％、83.59％，骨髓炎组与对照组相比，1周时胶原容积分数无显著性差异(P＞0.05)，2周及4周时胶原容积分数有显著性差异(P＜0.05);Western blot显示，对照组中在1周、2周、4周时TGF-β1/GAPDH灰度值比值分别为35.80％、34.86％、33.94％，骨髓炎组中在1周、2周、4周时TGF-β1/GAPDH灰度值比值分别为34.47％、80.52％、225.95％。骨髓炎组与对照组相比，1周时TGF-β1表达无显著性差异(P＞0.05)，2周及4周时TGF-β1表达水平增高，有显著性差异(P＜0.05);对照组中在1周、2周、4周时pSmad2/Smad2/3灰度值比值分别为8.10％、8.61％、8.93％，骨髓炎组中在1周、2周、4周时pSmad2/Smad2/3灰度值比值分别为8.34％、17.61％、33.71％。骨髓炎组与对照组相比，1周时pSmad2表达无显著性差异(P＞0.05)，2周及4周时pSmad2表达水平增高，有显著性差异(P＜0.05);对照组中在1周、2周、4周时pSmad3/Smad2/3灰度值比值分别为7.45％、6.35％、7.69％，骨髓炎组中在1周、2周、4周时pSmad3/Smad2/3灰度值比值分别为7.39％、15.54％、51.95％。骨髓炎组与对照组相比，1周时pSmad3表达无显著性差异(P＞0.05)，2周及4周时pSmad3表达水平增高，有显著性差异(P＜0.05);对照组中在1周、2周、4周时pERK1/2/ERK1/2灰度值比值分别为15.33％、13.86％、9.51％，骨髓炎组中在1周、2周、4周时pERK1/2/ERK1/2灰度值比值分别为16.37％、51.29％、49.30％。骨髓炎组与对照组相比，1周时pERK1/2表达无显著性差异(P＞0.05)，2周及4周时pERK1/2表达水平增高，有显著性差异(P＜0.05);对照组中在1周、2周、4周时CollagenⅠ/GAPDH灰度值比值分别为39.48％、33.51％、31.69％，骨髓炎组中在1周、2周、4周时CollagenⅠ/GAPDH灰度值比值分别为43.90％、15.54％、19.55％。骨髓炎组与对照组相比，1周时Collagen1表达无显著性差异(P＞0.05)，2周及4周时CollagenⅠ表达水平增高，有显著性差异(P＜0.05)。
　　研究结论
　　(1)骨髓炎周围软组织瘢痕化在术后14天出现，至术后28天瘢痕化程度逐渐增强。
　　(2)骨髓炎动物模型中，TGF-β1/Smad信号通路在术后14天被活化，至术后28天活化程度持续增加。
　　(3)骨髓炎动物模型中，ERK/MAPK信号通路在术后14天被活化，至术后28天活化程度持续增加。
　　(4) TGF-β1/Smad信号通路以及ERK/MAPK信号通路在骨髓炎周围软组织胶原沉积、瘢痕形成中起重要作用。提示这两条通路可作为抑制骨髓炎周围瘢痕形成的靶点。
　　第三章抑制TGF-β1/Smad及ERK/MAPK信号通路对大鼠骨髓炎软组织瘢痕形成的影响
　　研究背景
　　TGF-β1能够调控细胞的增殖与分化，这一过程主要由TGF-β1/Smad信号通路将细胞外信号传导至细胞核，调节相应的效应基因实现。在经典的TGF-β1/Smad信号通路中，TGF-β1首先与细胞膜上的TβRⅠ、Tβ RⅡ受体相结合，结合复合体将细胞浆中Smad2、Smad3活化，从而与Smad4相结合、转位至细胞核内调控靶基因转录。除经典的TGF-β1/Smad细胞信号通路，TGF-β1也介导非Smad依赖的信号通路，如通过激化Ras/Raf/MEK/ERK，最终激活ERK，调控靶基因转录，导致纤维细胞增殖。除TGF-β1介导两条单独的信号通路外，ERK与Smad也存在交叉对话，共同调节细胞的功能变化，两者之间的串话，主要经Smad2、Smad3连接区的磷酸化位点实现。在不同的细胞，ERK与Smad之间的串话，表现出抑制或促进细胞增殖的不同的生物学效应。目前，在骨髓炎周围软组织瘢痕形成的研究中，阻断TGF-β1/Smad与ERK/MAPK两条信号通路能否减轻软组织瘢痕化，以及ERK与Smad之间的串话对瘢痕形成产生怎样的影响，仍然未被阐明。
　　研究目的
　　1.在大鼠骨髓炎动物模型中阻断TGF-β1，研究阻断其介导的TGF-β1/Smad信号通路及ERK/MAPK信号通路，对骨髓炎周围软组织瘢痕形成的影响。
　　2.阻断ERK1/2，探讨ERK1/2与Smad2/3之间的串话，对大鼠骨髓炎周围软组织瘢痕形成的影响。
　　研究方法
　　1.20只wistar大鼠分为两组，A组为Decorin处理组，B组为骨髓炎模型组，每组10只实验动物。根据取材时间A、B两组各分为A1-2以及B1-2个亚组。骨髓炎模型组根据第一章模型制作方法，利用金黄色葡萄球菌制作大鼠骨髓炎动物模型。Decorin处理组于术后1，3，5天通过1ml注射器于骨髓炎周围软组织内肌肉注射Decorin50ug。骨髓炎组于术后1，3，5天于骨髓炎周围软组织内肌肉注射PBS0.5ml。分别于术后第14、28天取材。MASSON染色检测胶原沉积程度，Westernblot检测TGF-β1、Smad2/3、 ERK1/2以及Ⅰ型胶原的表达变化。
　　2.20只wistar大鼠分为两组，A组为PD98059处理组，B组为骨髓炎模型组，每组10只实验动物。根据取材时间A、B两组各分为A1-2以及B1-2个亚组。骨髓炎模型组根据第一章模型制作方法，利用金黄色葡萄球菌制作大鼠骨髓炎动物模型。PD98059处理组于术后1，3，5天通过1ml注射器于骨髓炎周围软组织内肌肉注射PD9805910mg/kg。骨髓炎组于术后1，3，5天通过1ml注射器于骨髓炎周围软组织内肌肉注射PBS0.5ml。分别于术后第14、28天取材。MASSON染色检测胶原沉积程度，Western blot检测ERK1/2、Smad2/3以及Ⅰ型胶原的表达变化。
　　研究结果
　　1.MASSON染色显示，Decorin处理组在2周、4周时胶原容积分数分别为15.55％、39.27％，骨髓炎组胶原容积分数在2周、4周时分别为48.57％、68.22％，Decorin处理组与骨髓炎组相比，2周及4周时胶原容积分数有显著性差异(P＜0.05)。Western blot显示，Decorin处理组在2周、4周时TGF-β1/GAPDH灰度值比值分别为1.16％、3.93％，骨髓炎组在2周、4周时TGF-β1/GAPDH灰度值比值分别为8.57％、15.22％，Decorin处理组与骨髓炎组相比，在2周、4周时TGF-β1表达有显著性差异(P＜0.05); Decorin处理组在2周、4周时pSmad2/Smad2/3灰度值比值分别为5.26％、4.01％，骨髓炎组在2周、4周时pSmad2/Smad2/3灰度值比值分别为8.60％、11.68％，Decorin处理组与骨髓炎组相比，在2周、4周时pSmad2表达有显著性差异(P＜0.05);Decorin处理组在2周、4周时pSmad3/Smad2/3灰度值比值分别为1.04％、2.44％，骨髓炎组在2周、4周时pSmad3/Smad2/3灰度值比值分别为9.02％、13.65％，Decorin处理组与骨髓炎组相比，在2周、4周时pSmad3表达有显著性差异(P＜0.05); Decorin处理组在2周、4周时pERK1/2/ERK1/2灰度值比值分别为17.94％、14.75％，骨髓炎组在2周、4周时pERK1/2/ERK1/2灰度值比值分别为48.99％、53.75％，Decorin处理组与骨髓炎组相比，在2周、4周时pERK1/2表达有显著性差异(P＜0.05);Decorin处理组在2周、4周时CollagenⅠ/ GAPDH灰度值比值分别为5.94％、4.75％，骨髓炎组在2周、4周时CollagenⅠ/GAPDH灰度值比值分别为15.99％、26.75％，Decorin处理组与骨髓炎组相比，在2周、4周时CollagenⅠ表达有显著性差异(P＜0.05);
　　2.MASSON染色显示，PD98059处理组在2周、4周时胶原容积分数分别为21.13％、39.79％，骨髓炎组胶原容积分数在2周、4周时分别为41.34％、63.61％，PD98059处理组与骨髓炎组相比，2周及4周时胶原容积分数有显著性差异(P＜0.05)。Western blot显示， PD98059处理组在2周、4周时pERK1/2/ERK1/2灰度值比值分别为9.18％、12.95％，骨髓炎组在2周、4周时pERK1/2/ERK1/2灰度值比值分别为39.99％、46.54％，PD98059处理组与骨髓炎组相比，在2周、4周时pERK1/2表达有显著性差异(P＜0.05); PD98059处理组在2周、4周时pSmad2/Smad2/3灰度值比值分别为3.24％、9.20％，骨髓炎组在2周、4周时pSmad2/Smad2/3灰度值比值分别为15.31％、21.44％，PD98059处理组与骨髓炎组相比，在2周、4周时pSmad2表达有显著性差异(P＜0.05); PD98059处理组在2周、4周时pSmad3/Smad2/3灰度值比值分别为0.96％、2.14％，骨髓炎组在2周、4周时pSmad3/Smad2/3灰度值比值分别为3.02％、12.35％，PD98059处理组与骨髓炎组相比，在2周、4周时pSmad3表达有显著性差异(P＜0.05); PD98059处理组在2周、4周时CollagenⅠ/GAPDH灰度值比值分别为4.40％、5.15％，骨髓炎组在2周、4周时CollagenⅠ/GAPDH灰度值比值分别为11.69％、18.65％，PD98059处理组与骨髓炎组相比，在2周、4周时CollagenⅠ表达有显著性差异(P＜0.05);
　　研究结论
　　1.在大鼠骨髓炎动物模型中，阻断TGF-β1介导的TGF-β1/Smad信号通路及ERK/MAPK信号通路，能够减轻骨髓炎周围软组织瘢痕的形成。
　　2.在大鼠骨髓炎动物模型中，阻断ERK1/2，ERK1/2与Smad2/3之间发生串话，能够减轻骨髓炎周围软组织瘢痕的形成。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

参考文献

第一章 大鼠骨髓炎动物模型的建立和评估

一、研究背景

二、材料和方法

三 研究结果

四 讨论

五 结论

附图表

参考文献

第二章 TGF-β1／Smad及ERK／MAPK信号通路的表达变化与大鼠骨髓炎周围软组织瘢痕形成之间的关系

一、研究背景

二、试验材料

三、实验方法

四 研究结果

五 讨论

六 结论

附图表

参考文献

第三章 抑制TGF-β1／Smad及ERK／MAPK信号通路对大鼠骨髓炎软组织瘢痕形成的影响

研究背景

一、试验材料

二、实验方法

三 研究结果

实验二 通过阻断ERK1／2研究ERK与Smad的交叉对话对骨髓炎软组织瘢痕形成的影响

一、试验材料

二、实验方法

三 研究结果

结论

附图表

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文

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