肌层浸润性膀胱癌中长链非编码RNA和miRNA差异表达谱及相关ceRNA调控网络的分析研究

摘要

研究背景与目的：
　　膀胱癌是泌尿系统常见肿瘤之一，严重危害人类的健康。肌层浸润性膀胱癌复发率及死亡率均较非肌层浸润性膀胱癌显著增高，是膀胱癌研究中的重点与热点。长链非编码RNA(lncRNA)是指一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA转录本，其自身不编码蛋白。最初lncRNA被认为在基因组转录中不起作用，近年来，这些过去被认为是“垃圾序列”的lncRNA越来越引起学者的重视，其具有重要的生物学功能。研究表明，对于某些特定的lncRNA，其在正常组织和肿瘤组织中表达水平有明显差异，而且有些差异和肿瘤的分期及预后也密切相关。目前，lncRNA相关研究已成为肿瘤分子生物学研究热点，就泌尿系肿瘤来讲，前列腺癌相关lncRNA研究开始较早，相关热点lncRNA包括前列腺癌基因表达标志物1(PCGEM1)、前列腺特异性抗原3(DD3/PCA3)、前列腺癌非编码RNA1(PRNCR1)等。膀胱癌方面的相关lncRNA研究尚处于研究进展期。
　　lncRNA和miRNA的相互作用在肿瘤的发生发展中起到了重要调节作用。2011年，竞争性内源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)假说在此基础上被提出，并被越来越多的研究试验所证实。ceRNA并非是一种新发现的RNA，而是一种RNA相互作用的调节机制，这一机制认为lncRNA、miRNA、mRNA及其它RNAs之间是功能互相调控的，这些RNA之间正常时处于一种平衡稳态，一旦其中某一个或几个RNA表达出现异常上调或下调，它们之间的这种平衡稳态就会失衡破坏，就会导致相关疾病发生。lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA调控网作为一种新的假说，越来越被研究重视，并已在胃癌、乳腺癌、胰腺癌和肝癌中得以构建。目前仍缺乏在全基因组范围内，特别是基于高通量检测与大规模样本量的肌层浸润性膀胱癌相关的lncRNA和miRNA及的ceRNA的综合分析。
　　癌症基因图谱计划(The Cancer Genome Atlas，TCGA)项目组最初由美国国家肿瘤研究所(NCI)和美国国家人类基因组研究所(NHGRI)组成，目前其中已经收集了超过30种人类癌症种类，共约10000例患者样本和临床病理信息，并且数据全部免费开放，TCGA的最终目标为所有的癌症基因组构建一套相关的完整“图谱”。在TCGA数据库中，免费数据不仅包括全而详实的临床病例资料，还包括患者分子水平测序结果。目前，已经有超过5万个lncRNA基因在人类基因组中被克隆和鉴定，但仅有其中极少一部分的生物学功能得到相关验证。如何寻找特定肿瘤的功能性lncRNA是相当困难的。TCGA数据库相当于肿瘤临床及分子信息的一个蕴藏丰富的宝库，如何从这一宝库中甄选出我们希望挖掘的宝藏，就需要严谨科学的工具。这就需要借助生物信息学工具，及相关测序统计工具，我们可以从大数据中摒弃无关信息，发现潜在研究位点。
　　研究方法：
　　生物信息学是计算机科学、数学和生物学界面的一门多学科的交叉学科。它依赖计算机科学、工程和应用数学的基础，依赖实验和衍生数据的大量贮存。在本研究中，借助生物信息学分析技术，通过TCGA数据库提取共341个样本的3级RNAseq和miRNASeq数据。数据分为2个队列:322例肌层浸润性膀胱癌和19例正常样本。肿瘤样本与正常样本数据进行数据处理后，所有未表达的RNA数据和miRNA数据被滤除。所得数据通过DESeq软件进行处理，得到肌层浸润性膀胱癌差异表达RNA(differentially expressed RNA，DERNA)和差异表达miRNA(differentially expressed miRNA，DEmiRNA)，进而借助GENCODE lncRNA数据库（第22版）从中确认差异表达lncRNA。得到肌层浸润性膀胱癌的DElncRNA和DEmiRNA后，借助miRcode数据库预测lncRNA-miRNA的相互作用，借助miRTarBase数据库检索miRNA靶向的mRNAs，进而成功构建其lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA调控网。
　　为进一步论证TCGA数据库分析得出的肌层浸润性膀胱癌中长链非编码RNA差异表达谱的科学性，我们筛选研究中预测的3个表达上调lncRNA(LINC00162、AATBC、UCA1)和4个表达下调lncRNA(MIR100HG、MIR143HG、C20orf166-AS1、HAND2-AS1)做进一步的初步试验验证。通过Real-Time PCR检测32对肌层浸润性膀胱癌和癌旁正常组织标本中上述7个差异表达lncRNA，并进一步选取目前尚未在膀胱癌中报道的长链非编吗RNA HAND2-AS1做进一步初步功能验证。通过Real-Time PCR检测HAND2-AS1在SV-HUC-1和膀胱癌细胞株5637，RT4和J82的表达情况，进一步通过MTT计数法和划痕实验、Transwell，我们验证了HAND2-AS1对膀胱癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力的影响。
　　结果：
　　1.肌层浸润性膀胱癌中lncRNA和miRNA差异表达谱及相关ceRNA调控网络的分析研究
　　1.1.肌层浸润性膀胱癌中的差异表达RNA(differentially expressed RNAs，DERNAs)
　　研究将322个肌层浸润性膀胱癌肿瘤组织（队列T）和19个正常组织(队列N)中的RNA的表达水平进行研究。差异表达基因定义为差异倍数(log2)绝对值大于1且校正P值小于0.01的基因。通过此标准进行计算机处理，结果共有472(34.08％)个表达上调和913(65.92％)个表达下调的RNA被确认（见附表1）。同时，为了更好地解释肌层浸润性膀胱癌发生的相关机制，这些差异表达DERNA的功能特性被通过KOBAS2.0进行KEGG分析。27个DERNA（包括21个表达上调者和6个表达下调者）被发现参与细胞周期。
　　1.2.肌层浸润性膀胱癌中的差异表达lncRNA(differentially expressed lncRNAs，DElnRNAs)
　　根据差异倍数(log2)绝对值＞1.5和校正P值＜0.01这一判定标准，在肌层浸润性膀胱癌中，我们发现有4个lncRNA（LINC00162、AATBC、UCA1和EPR1）的表达显著上调，有7个lncRNA(MIR2HG、MIR100HG、BRE-AS1、M1R143HG、C20orf166-AS1、HAND2-AS1和PGM5-AS1，)被证明表达下调。根据肿瘤组织样本病理TNM分期，将样本分为T3+T4对比T1+T2， N2+N3对比N0+N1，M1对比M0以及有淋巴脉管浸润对比无淋巴脉管浸润这些亚组，进而对样本的lncRNA表达谱进行相关的比较分析，我们确定了8个表达上调lncRNA(LINC00221、UCA1、ZFHX4-AS1、LINC00284、LOC283731、LINC00698、CNTFR-AS1和LOC284379)和4个表达下调lncRNA（LINC00390、SSTR5-AS1、HECTD2-AS1和LOC400696）和肌层浸润性膀胱癌的疾病进展分期密切相关。
　　1.3.肌层浸润性膀胱癌中的差异表达miRNA(differentially expressed miRNAs，DEmiRNAs)
　　为了构建lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA调控网，我们还比较了肿瘤组织和正常组织中的miRNA表达谱。确定了11个差异表达miRNA，包括2个表达上调和9个表达下调的miRNA。利用Kaplan-Meier曲线分析法研究肌层浸润性膀胱癌患者DEmiRNA相关的总生存率，这11个DEmiRNA中有5个（包括let-7c、mir-100、mir-143、mir-1-2和mir-145）被证明与患者生存率相关。
　　1.4.肌层浸润性膀胱癌中的相关eeRNA调控网的构建
　　我们基于以上数据构建了一个lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA调控网。分析得出有32个DERNA参与了ceRNA调控网，这32个DERNA中，部分已被报道为癌症相关基因，如CDC25A、 CDKN1A、 MMP1、 MMP13和SOX4。同时，我们对调控网中所包含的DElncRNA和DERNA的表达水平进行了回归分析，结果显示了参与ceRNA的lncRNA和mRNA表达水平之间具有非常一致甚至近乎完美的相互作用关系。我们还分析了参与ceRNA调控网的32个DERNA，分析了由DElncRNA间接调控的信号传导通路，证实有10条KEGG通路中上述DERNA显著富集，其中包括4条肿瘤相关通路:肿瘤MicroRNAs、膀胱癌、细胞周期和慢性粒细胞白血病”。
　　2.肌层浸润性膀胱癌中lncRNA差异表达谱的初步验证及HAND2-AS1初步功能研究
　　2.1.膀胱癌中相关差异表达lncRNA的real-time PCR检测结果
　　我们从相关lncRNA差异表达谱中选取了3个预测表达上调和4个预测表达下调的lncRNA进行初步验证。定量Real-Time PCR检测了共计32对膀胱癌肿瘤组织和癌旁组织标本中7个lncRNA的表达情况。试验结果表明:前期研究预测上调的lncRNA包括AATBC与UCA1，试验结果与前期预测结果相符。前期研究预测下调的lncRNA包括MIR100HG、MIR143HG、C20orf166-AS1、HAND2-AS1，试验结果与前期预测结果均相符。LINC00162在前期TCGA预测分析中为上调，Real-Time PCR试验结果为下调。7个lncRNAs总体预测与试验符合率为85.7％。
　　2.2.膀胱癌细胞株中HAND2-AS1基因的Real-Time PCR检测结果
　　采用定量Real-Time PCR方法检测SV-HUC-1，5637，RT4和J82四株细胞系中HAND2-AS1的表达情况。结果显示HAND2-AS1确实在膀胱癌细胞株中低表达。
　　2.3.HAND2-AS1对于膀胱癌细胞的增殖、侵袭及迁移的作用。
　　设计干扰RNA下调HAND2-AS1在5637细胞株中的表达，结果显示干扰后细胞中HAND2-AS1的表达显著降低，细胞增殖曲线显示HAND2-AS1基因下调后，5637细胞的增殖明显加快。同时，通过划痕实验及Transwell法对比分析，试验初步验证HAND2-AS1抑制膀胱癌细胞的增殖、侵袭及迁移。
　　结论：
　　1.基于TCGA数据库大样本肌层浸润性膀胱癌标本数据分析，得出肌层浸润性膀胱癌的差异表达lncRNA谱及差异表达miRNA谱，借此构建相关lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA调控网。通过相关通路分析证实，肌层浸润性膀胱癌的发生发展中多种lncRNA与miRNA参与相关ceRNA调控网，在多项信号转导通路中共同发挥作用。
　　2.基于TCGA数据库大样本肌层浸润性膀胱癌标本数据分析，得出肌层浸润性膀胱癌差异表达lncRNA表达谱，通过定量Real-Time PCR法初步验证AATBC与UCA1在膀胱癌中表达显著上调，MIR100HG、MIR143HG、C20orf166-AS1、HAND2-AS1在膀胱癌中表达显著下调，其初步试验结果与前期数据分析结果均一致。除此7个lncRNA外，尚有多个预测lncRNA需下一步试验验证。
　　3.基于TCGA数据库大样本肌层浸润性膀胱癌标本数据分析及初步组织标本验汪，首次发现并预测HAND2-AS1在膀胱癌中的抑癌作用。设计初步试验验证该结论。初步试验研究证实HAND2-AS1可以抑制膀胱癌细胞的增殖、侵袭及迁移，但其过表达质粒构建及下一步相关动物实验需进一步进行。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章：肌层浸润性膀胱癌中长链非编码RNR和miRNA差异表达谱及相关ceRNA调控网络的分析研究

1 研究背景

2 材料和方法

3 研究结果

3．1 患者特征

3．2 肌层浸润性膀胱癌中的差异表达RNA

3．3 肌层浸润性膀胱癌中的差异表达lncRNA

3．4 肌层浸润性膀胱癌中的差异表达miRNA

3．5 肌层浸润性膀胱癌中的ceRNA调控网的构建

4 讨论

5 结论

参考文献

第二章：肌层浸润性膀胱癌中差异表达lncRNA的初步验证及HAND2-AS1初步功能研究

1．前言

2．材料和方法

3 实验结果

3．1 膀胱癌中相关差异表达lncRNA的real-time PCR检测结果

3．2 Real-TimePCR法检测HAND2-AS1在膀胱癌细胞株中的表达

3．3 HAND2-AS1在膀胱癌细胞增殖中的作用

3．4 HAND2-AS1的表达对膀胱癌细胞迁移和侵袭能力的影响

4 讨论

5 结论

6 研究总结论

参考文献

第三章 综述 长链非编码RNA在泌尿系恶性肿瘤中的研究进展

致谢

攻读博士学位期间发表的学术论文

攻读博士学位期间参加的科研项目

英文论文1

附表1

附表2