抗GD1a抗体对小鼠脊髓前角运动神经元中Neogenin表达的影响

摘要

目的：吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barrésyndrome，GBS)是一种自身免疫介导的周围神经病，以急性迟缓性瘫痪和脑脊液蛋白-细胞分离为特征，是神经系统发病率相对较高、致残疾较重的自身免疫性疾病。轴索型GBS是我国GBS最常见类型，急性运动轴索型神经病(acute motor axonal neuropathy，AMAN)是轴索型GBS中常见类型。AMAN是一种与前驱感染密切相关的疾病，最常见的感染病原体是空肠弯曲菌。研究发现，空肠弯曲菌外膜上的脂多糖与人轴索的神经节苷脂存在分子模拟，产生的抗体破坏富含神经节苷脂的周围神经诱发轴索变性而介导发病。AMAN的致病性抗体为抗GD1a抗体或抗GM1抗体，但是其具体机制尚不明确。目前治疗GBS的方法主要有免疫球蛋白和血浆置换，但临床资料表明此方法仅对大部分患者有效，仍有部分患者经积极治疗后遗留后遗症甚至死亡。与其他类型的GBS相比，AMAN患者在治疗后效果差、预后差。因此，研究AMAN的发病机制并找出治疗该病的有效办法是十分必要的。
　　Neogenin是一种在各组织中表达广泛的Ⅰ型跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族。Neogenin在神经系统及迁移、增值和分化旺盛的部位大量表达。Neogenin是一种轴索导向因子受体，其配体有神经导向因子Netrin、排斥性导向分子RGM（Repulsive guidance molecule，RGM）等。Netrin可通过与其特异性配体Neogenin相互作用后介导神经细胞的迁移和轴突的导向生长。Neogenin和配体RGMa结合后可通过可诱导生长锥的崩解，进而抑制损伤后的轴索再生过程。大量研究证实，Neogenin是调控神经发生以及轴突导向的关键分子。然而，Neogenin是否与AMAN的发生、进展有关，目前国内外尚无相关研究。
　　本实验成功利用单梯度的OptiPrep分离液经密度梯度离心获得高纯度小鼠脊髓前角运动神经元，选取AMAN的其中一种致病性抗体抗GD1a抗体进行实验，加入该抗体干预运动神经元建立AMAN的细胞模型，通过轴索生长测定、生长锥崩解实验验证AMAN患者血清中的抗GD1a抗体对体外培养的运动神经元的影响，将抗GD1a抗体阳性AMAN患者血清、健康人血清加入到运动神经元中，检测Neogenin的mRNA和蛋白的表达水平。本实验旨在探究抗GD1a抗体对小鼠脊髓前角运动神经元Neogenin表达的影响，探索Neogenin能否成为AMAN治疗的新靶点。
　　方法：本实验分离E13.5天的C57BL/6胎鼠脊髓，0.25％的胰酶消化成单个细胞，过滤去掉未消化好的组织团块，细胞悬液经过OptiPrep分离液密度梯度离心后获得脊髓前角运动神经元，加入无血清的NABG培养基爬片培养，观察不同时间点的运动神经元细胞形态，免疫荧光双标法鉴定分离运动神经元的纯度。将分离的小鼠脊髓运动神经元加入抗GD1a抗体干预建立AMAN的细胞模型，不加任何干预的作为空白对照组，分别在培养36、48小时后，用Image-Pro Plus6.0软件对神经元的轴突长度进行测定，在培养36小时后，免疫荧光法染色F-actin显示生长锥的形态，计算生长锥崩解的数量。利用免疫荧光检测运动神经元Neogenin的表达情况。将分离的小鼠脊髓前角运动神经元按照随机原则分为三组，AMAN血清组（加入抗GD1a抗体阳性的AMAN血清）、健康血清组（加入年龄和性别匹配的健康人血清）和空白对照组，培养36小时后，荧光定量PCR检测Neogenin的mRNA的水平，Western blot检测Neogenin蛋白的表达水平。
　　结果：1、分离的运动神经元观察到典型的神经元细胞形态及轴突生长。分离的运动神经元在10分钟-20分钟左右完全贴壁，在接种12时后，运动神经元细胞伸出了几个短小的突起。培养至48小时，神经元细胞的延伸出了多个树突及其分支。培养至72小时后，在相邻神经元之间形成纤维网络。2、免疫荧光染色SMI-32抗体、ChAT抗体双标阳性证明培养的细胞为运动神经元细胞，纯度约为90％-95％。3、与空白对照组相比，36小时、48小时抗GD1a抗体干预组轴突长度差异有统计学意义(P＜0.001)。与空白对照组相比，36小时抗GD1a抗体干预组生长锥的数量差异有统计学意义(P＜0.001)。4、与空白对照组相比，健康血清组Neogenin的mRNA表达水平差异无统计学意义(P=0.933)，与健康血清组相比，AMAN血清组Neogenin的表达水平差异有统计学意义(P＜0.001)，Western blot检测结果表明AMAN血清组Neogenin的蛋白水平亦显著上调。
　　结论：1、本实验成功探索出利用单梯度的OptiPrep分离液来分离小鼠脊髓前角运动神经元的新方法，为运动神经元相关的研究提供了依据。2、抗GD1a抗体对体外培养的小鼠脊髓前角运动神经元的轴索生长有抑制作用，对生长锥的崩解有促进作用。3、抗GD1a抗体显著上调小鼠脊髓前角运动神经元中Neogenin的表达。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

材料及方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

综述 吉兰-巴雷综合征的免疫治疗进展

附图

致谢

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