TERT-YAP介导的永生化牙周膜干细胞系的构建及其调控机制的研究

摘要

目的：
　　本实验旨研究Hippo/YAP信号通路介导人永生化人牙周膜干细胞系建立及机制。通过过表达TERT基因的慢病毒转染人牙周膜干细胞，建立永生化人牙周膜干细胞系。通过检测过表达TERT基因后的牙周膜干细胞Hippo/YAP信号通路中YAP/TAZ蛋白表达水平是否改变，并在此基础上加入YAP抑制剂维替泊芬，以此揭示Hippo/YAP信号通路介导人永生化人牙周膜干细胞系建立及作用机制，进一步深入认识永生化人牙周膜干细胞系建立的调控机制，为牙周膜干细胞用于牙周组织修复再生、治疗牙周疾病提供实验依据。
　　方法：
　　1.使用酶消化组织块法分离获得原代人牙周膜干细胞;使用流式细胞术进行鉴定干细胞表面标志物的表达水平;检测所得细胞成骨、成脂及成软骨分化能力。
　　2.过表达TERT基因的慢病毒转染人牙周膜干细胞;EdU染色法和CCK-8法检测细胞增殖;流式细胞术和Tunel染色法检测细胞凋亡;β-半乳糖苷酶染色法检测细胞衰老;成骨诱导液矿化诱导检测成骨分化能力;裸鼠荷瘤实验检测细胞的成瘤性。
　　3.Western Blot和实时荧光定量qRT-PCR检测增殖、凋亡、衰老及成骨基因的表达。使用维替泊芬抑制剂后再次检测细胞生物学性状改变。
　　结果：
　　1.成功分离出原代牙周膜干细胞并体外培养;阳性表达干细胞标志物;具有成骨、成脂及成软骨分化的多向分化潜能。
　　2.转染后牙周膜干细胞成功过表达TERT基因;过表达TERT基因后，牙周膜干细胞增殖能力变强，凋亡及衰老减少，成骨分化能力保持，并不随传代次数增多而减弱;未表现成瘤性。
　　3.建立的永生化人牙周膜干细胞系中Hippo/YAP信号通路中YAP及其上游的MST2、SAV1、MOB、LATS1蛋白表达升高;使用抑制剂抑制YAP后，牙周膜干细胞系增殖能力减弱，凋亡和衰老细胞增多;使用抑制剂抑制YAP后，增殖相关蛋白AKT、ERK表达水平降低。
　　结论：
　　1.成功通过过表达TERT的方法建立永生化人牙周膜干细胞系，为下一步实验及牙周膜干细胞的大量使用提供细胞来源;
　　2.已证明在永生化人牙周膜干细胞系建立过程中，Hippo/YAP信号通路中关键蛋白表达水平改变，表明Hippo/YAP信号通路参与了该永生化人牙周膜干细胞系建立，直接或间接介导了该永生化人牙周膜干细胞系建立;
　　3.使用YAP抑制剂抑制YAP发挥功能后，该细胞系不能再永生化，证明过表达TERT基因来建立永生化人牙周膜干细胞系的这一过程会通过调控Hippo/YAP信号通路来实现，Hippo/YAP信号通路在永生化人牙周膜干细胞系建立过程中起到关键作用。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

第一部分 hPDLSCs的体外分离、培养及鉴定

1 实验材料与方法

1．1 主要实验试剂

1．2 主要仪器设备

1．3 实验方法

2 实验结果

3．讨论

4．结论

第二部分 永生化人牙周膜干细胞系的建立

1 实验材料与方法

1．1 主要实验试剂

1．2 主要实验设备

1．3 实验方法

2．实验结果

3．讨论

4．结论

第三部分 过表达IERT对Hippo／YhP信号通路的影响

1 实验材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

第四部分 抑制YAP后永生化人牙周膜干细胞系生物学行为改变

1 实验材料与方法

1．1 主要实验试剂

2 结果

3 讨论

4 结论

全文总结

参考文献

致谢

硕士期间发表论文