米曲霉尼古丁去甲基酶的筛选与克隆表达分析

摘要

尼古丁(Nicotine)是烟草植物中主要的生物碱，广泛存在于烟草制品中。吸烟对人体有害，大量的人因为吸烟而死亡，到2020年，预计每年会有超过900万的人因为吸烟而死亡。尼古丁是一种拟交感神经药，释放儿茶酚胺，能增加心率和心肌收缩力，缩短皮肤和冠状动脉血管，短暂升高血压，降低对胰岛素的敏感性，可能加重糖尿病，并可能导致内皮功能障碍。由于烟草制品使用量的增加，烟草行业产生了含有高浓度尼古丁的固体和液体烟草废料，尼古丁易溶解于水导致地下水的污染，进而会扰乱土壤的生态平衡。因此，为了防止尼古丁污染土壤和水，除去烟草废料中的尼古丁相当重要。
　　尼古丁在人体、植物和微生物的降解已经有很多报道。在人体中，尼古丁被肝脏代谢成多种代谢物，其中的六种主要代谢产物为可替宁、1'-(R)-2'-(S)-顺式尼古丁-N氧化物和1'-(S)-2'-(S)-反式尼古丁-N氧化物、N-甲基烟碱离子、尼古丁葡萄糖醛酸苷、2'-羟基烟碱以及去甲基尼古丁。尼古丁的去甲基化代谢是尼古丁在全身清除中相对较小的途径，目前报道与尼古丁去甲基有关的酶为CYP2A6、CYP2B6、CYP2D6等。尼古丁在烟草植物中也是由尼古丁去甲基酶催化生成去甲基尼古丁的，目前报道CYP82E4、CYP82E5v2和CYP82E10为尼古丁去甲基酶。CYP82E4一般存在于衰老的叶片，CYP82E5v2主要存在于新鲜的叶片，而CYP82E10主要在根部表达。微生物对尼古丁有很强的降解能力，开发和利用尼古丁降解的微生物资源，对维持生态平衡有重大影响。因此，越来越多的尼古丁代谢已经得到了研究。在微生物中尼古丁降解主要有三种途径:吡啶途径、吡咯途径以及去甲基化途径。其中，节杆菌属和假单胞菌属分别是吡咯途径和吡啶途径的典型代表。去甲基化途径在真菌中已经报道，但是尼古丁代谢途径的研究仅为发现初始步骤为尼古丁的去甲基化。本实验室在国际上首次提出一条全新的米曲霉Aspergillus oryzae112822降解尼古丁的代谢途径，填补了真菌尼古丁代谢途径的空白，但是该代谢途径涉及到的酶及其分子生物学研究仍属于空白。
　　目前，已经确定生物体中尼古丁的去甲基化是由P450单加氧酶催化，细胞色素P450大多数属于膜蛋白。膜蛋白的过表达问题是其功能和结构研究中的主要瓶颈，目前已经开发了多种异源表达系统来表达膜蛋白。例如，大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、杆状病毒/昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统和无细胞表达系统，它们对于膜蛋白的表达各有优缺点，因此选择合适的表达系统是非常重要的。大肠杆菌是表达重组蛋白最常用的宿主系统，有研究人员开发了一些优化P450在大肠杆菌中表达的实验策略，例如N-端修饰、分子伴侣蛋白共表达、载体的选择和密码子优化的基因合成等，这些策略对于P450的表达是值得借鉴的。
　　本文针对米曲霉A.oryzae112822降解尼古丁第一步反应的尼古丁去甲基酶展开研究，第一步反应需要CYP和CPR的共同参与。本实验室的前期工作已经通过酶的分离纯化、肽谱分析和转录组测序分析技术筛选了9个候选蛋白。成功克隆了CYP1、CYP2、CYP3、CYP4、CYP5、CYP7、CYP8、CYP9和CYP10的基因，并且也同时克隆了米曲霉和酿酒酵母的NADPH-细胞色素P450还原酶(CPR)的基因。我们提取了米曲霉和酿酒酵母的RNA，并将其反转录成cDNA，以cDNA为模板成功地克隆出了相应的CYP和CPR的基因。随后，针对这9个CYP和2个CPR的异源表达和功能研究开展工作，我们首先尝试在大肠杆菌中表达CYP和CPR，其中，米曲霉CPR和酿酒酵母CPR成功获得了可溶性表达并且具有电子传递活性;CYP1、CYP2、CYP5、CYP8和CYP10也获得了表达，但是除了CYP8外，其余都形成包涵体，无法检测酶蛋白的活性。只有CYP8能够与CO结合形成450nm的特征吸收峰，将CYP8分别与Ao.CPR和Se.CPR进行尼古丁的降解活性实验，没有检测到尼古丁的减少与去甲基尼古丁的生成。据报道，CYP8是一种一氧化氮还原酶，在NAD(P)H的存在下，能直接将NO还原为N2O而不需要CPR的参与。为了验证CYP8的底物活性，设计实验通过检测NADH的特征吸收峰340nm的减少来判断CYP8的催化活性。结果发现，在NADH存在的条件下，CYP8能降低340nm处的吸收峰，说明CYP8具有催化NO的能力。
　　根据肽谱分析和转录组分析，CYP1的肽谱匹配率为10％，转录上调最高，推测CYP1最有可能是尼古丁去甲基酶。因此，为了增加CYP1在大肠杆菌中的可溶性表达，通过N-端跨膜域的截短和加入亲水性的氨基酸序列修饰N-端等方法构建了表达载体，对CYP1进行了5种N-端修饰，分别为1.Native(MA-);2.CYP1△(3-28);3.CYP1(17α);4.CYP1(2C3);5.CYP1(2E1)。使用了pCWori、pET21b、pET22b和pET28b等4种不同的表达载体，以及DH5α、BL21、RosettagamiB和JM109等4种不同的大肠杆菌表达系统进行CYP1的表达，以探索CYP1的最佳N-端修饰序列以及最佳的表达载体与表达宿主的组合。成功地克隆出5种N-端修饰的CYP1，并且成功地构建相应的4种表达载体。最后，筛选出了56株表达菌株，但是其中只有15株菌株能表达目的蛋白，并且都以包涵体形式表达。本文成功的克隆了米曲霉的9个CYP与米曲霉和酿酒酵母CPR，验证了CYP8的底物催化活性以及探索了CYP1的N-端序列修饰的表达。最后，我们将人体与植物中已知存在的尼古丁去甲基酶的氨基酸序列的在米曲霉基因组中比对，发现CYP620亚家族具有较高的氨基酸序列相似性。结合肽谱分析与转录组分析，发现CYP620H1与CYP620H2极有可能是米曲霉中的尼古丁去甲基酶。研究中还存在许多问题以及不足之处，本文的研究和探索为后续的研究提供了一定借鉴与经验。

目录

声明

摘要

缩略词表

第1章 前言

1．1 尼古丁的化学结构与性质

1．2 尼古丁的危害与污染现状

1．3 尼古丁的降解研究进展

1．3．1 尼古丁在人体中的降解代谢

1．3．2 尼古丁在植物中的降解代谢

1．3．3 尼古丁在微生物中的降解代谢

1．4 尼古丁去甲基化反应机制研究进展

1．4．1 甲基转移假说

1．4．2 氧化去甲基假说

1．4．3 酶促氧化去甲基学说

1．5 细胞色素P450研究进展

1．6 膜蛋白表达研究进展

1．6．1 大肠杆菌表达系统

1．6．2 酵母表达系统

1．6．3 杆状病毒／昆虫细胞表达系统

1．6．4 哺乳表达系统

1．6．5 无细胞表达系统

1．7 细胞色素P450的表达策略研究进展

1．7．1 N-端修饰

1．7．2 同义突变

1．7．3 第二个密码子突变以编码丙氨酸

1．7．4 载体构建

1．7．5 分子伴侣系统

1．7．6 外界因素

1．8 本论文的意义及研究内容

第2章 CYP与CPR的基因克隆与载体构建

2．1 材料与方法

2．1．1 菌株、质粒和培养基

2．1．2 试剂和仪器

2．1．3 cyp与cpr的基因克隆

2．1．4 RNA提取与纯化

2．1．5 重组质粒构建与筛选鉴定

2．2 结果与讨论

2．2．1 目的基因扩增

2．2．2 重组质粒构建与筛选鉴定

2．2．3 DNA测序

2．2．2 讨论

第3章 CYP和CPR在大肠杆菌中的表达

3．1 材料与方法

3．1．1 菌株、质粒和培养基

3．1．2 试剂和仪器

3．1．3 目的蛋白的诱导表达

3．1．4 粗酶的制备

3．1．5 活性分析

3．2 结果和讨论

3．2．1 目的蛋白的表达及检测

3．2．2 CYP的活性检测

3．2．3 CPR的活性检测

3．2．4 尼古丁降解活性检测

3．2．5 CYP8的催化活性分析

3．2．6 讨论

第4章 CYP1的N-端修饰与表达及尼古丁去甲基酶的氨基酸序列分析

4．1 材料和方法

4．1．1 菌株、质粒和培养基

4．1．2 试剂和仪器

4．1．3 CYP1的N-端修饰载体构建

4．1．4 目的蛋白的表达和检测．

4．2．2 CYP1 N-端的载体构建

4．2．3 目的蛋白的表达检测以及活性检测

4．2．4 尼古丁去甲基酶的氨基酸序列分析

4．2．5 讨论

全文总结

参考文献

致谢