大白菜产量相关性状的QTL定位及叶片毛刺基因的精细定位与克隆

摘要

大白菜（Brassica rapa L.pekinensis）起源于中国，是我国栽培面积和生产供应数量最大的蔬菜作物，在我国蔬菜周年生产、周年供应和稳定市场等方面起着重要作用，具有重要的经济价值。大白菜又名结球白菜，叶球是其营养储备和食用的最主要器官，叶球相关性状是大白菜育种过程中重点考虑的产量性状，定位大白菜叶球相关性状的QTL位点，对实现大白菜分子设计育种、阐明大白菜叶球发育的遗传和分子机制具有重要意义。因此，本研究利用EST-SSR分子标记，以ZHB×G291的F2代分离群体作为构图群体，构建了大白菜的遗传连锁图谱，并对大白菜产量相关重要农艺性状进行了QTL定位，为探究影响大白菜产量的重要QTL位点提供信息。叶片毛刺是大白菜抵抗病虫侵害、减少蒸腾作用、预防紫外线的天然物理屏障，虽然对大白菜的正常生长具有重要作用，但是在大白菜生产和销售过程中，人们更倾向于选择无毛的大白菜品种。因此，本研究根据QTL定位的结果，进一步对大白菜叶片毛刺性状进行了精细定位，并分离了关键调控基因，揭示了该基因在叶片毛刺形成中扮演的角色。主要结果如下:
　　1.大白菜遗传连锁图谱的构建
　　以叶面光滑无毛刺大白菜“ZHB”为母本，叶面有毛刺大白菜“G291”为父本，构建了包括240个单株的F2代分离群体，对分布于大白菜10个连锁群上的500个EST-SSR标记进行了筛选，筛选出了106对在亲本间具有多态性的EST-SSR标记，多态性达21％。将这些标记锚定于连锁群上，制作出一张覆盖基因组2270.58cM的大白菜遗传连锁图谱。
　　2.大白菜重要农艺性状的调查和分析
　　对上述240个F2单株的田间重要农艺性状（包括毛重、球重、球高、球宽、球叶数、外叶数、最大叶长、最大叶宽、最大叶中肋长、最大叶中肋宽及叶片毛刺共11个性状）进行调查和分析。结果表明，毛重、球重、球高、球宽、球叶数、外叶数、最大叶长、最大叶宽、最大叶中肋长和最大叶中肋宽在群体中呈正态分布，为数量性状;叶片有毛刺与无毛刺的株数之比符合3∶1的分离比，为质量性状。我们对这些农艺性状的相关性进行了分析，结果表明，毛重与球重相关性最高，其次是球宽、最大叶宽、球高、最大叶中肋宽、最大叶长、球叶数和最大叶中肋长，而外叶数与球重相关性不显著，因此，除外叶数外，以上相关性状均与大白菜产量极为相关，是育种需要考虑的重要性状。
　　3.大白菜重要性状的QTL定位
　　利用构建的大白菜遗传连锁图谱，结合田间试验数据，对大白菜毛重、球重、球高、球宽、球叶数、外叶数、最大叶长、最大叶宽、最大叶中肋长、最大叶中肋宽及叶片毛刺等11个性状进行了QTL定位，共定位到20个QTL位点。其中，控制毛重性状的QTL位点1个，位于A03染色体上;控制球重性状的QTL位点1个，位于A10染色体上;与外叶数相关的QTL有3个，分别定位于A03、A04和A07染色体上，其中A04上的QTL贡献率最大;与球叶数相关的QTL位点1个，定位于A02染色体上;控制最大叶长性状的QTL位点最多，为7个，分别在A01、A02、A04、A09和A10染色体上各1个，在A.03染色体上有2个，其中1个QTL位点贡献率最大，为19.8％;3个控制最大叶宽的QTL，分别定位于A02、A05和A10号染色体上，其中在A05染色体上的QTL贡献率最大;与最大叶中肋长相关的QTL位点3个，定位于A02、A08、A09染色体上，其中在A09染色体上贡献率最大;与叶片毛刺相关的位点1个，定位于A06染色体上，其贡献率为47％;本实验没有定位到球高、球宽和最大叶中肋宽的QTL位点。
　　4.大白菜叶片毛刺基因的精细定位及候选基因的克隆、标记开发与验证
　　进一步扩大F2分离群体至1456株，对毛刺性状进行了鉴定和精细定位。结果表明，大白菜叶片毛刺性状由单显性基因控制（x2=1.06＜3.841）。加密A06连锁群上SSR分子标记，将控制叶面毛刺的基因精细定位于A6S95-A6S103标记之间，其物理距离为0.55Mb，从中筛选到一个候选基因BraGL1。对该基因的CDS序列、基因组序列及启动子序列进行了克隆和序列分析，结果发现，与对照有毛刺大白菜品种“G291”相比，该基因在无毛刺大白菜品种“ZHB”的第三个外显子区有5个碱基的缺失，造成蛋白质翻译提前终止，这可能导致该基因功能的缺失，叶面出现无毛刺表型;同时发现，“ZHB”5'UTR区有12个碱基的缺失。对BraGL1基因表达模式的分析结果表明，该基因在叶面无毛刺品种“ZHB”中的表达量显著高于其在叶面有毛刺品种“G291”中的表达量，表明启动子区的缺失可能会影响其转录水平，有待进一步研究。根据两亲本BraGL1基因在CDS区及5'UTR区的序列差异，分别开发了2个InDel标记，并在F2分离群体、市售大白菜品种及大白菜自交系种质资源中进行了验证，发现这2个标记与叶片毛刺表型完全连锁。
　　5.大白菜子叶、真叶及茎生叶的基因表达谱分析
　　对ZHB×G291F2代叶片有毛刺大白菜和叶片无毛刺大白菜的子叶、真叶和茎生叶进行表达谱分析，共得到430.59Mb Clean reads，检测到35，305个表达基因，从中筛选出266个可能与叶片毛刺发育相关的差异表达基因，其中包括8类转录因子（5个WRKY转录因子、3个MYB类转录因子、3个bHLH类转录因子、3个乙烯响应类转录因子、1个NAC转录因子和3个其它类转录因子）。此外，GL3、EGL1和SAD2可能在大白菜叶片毛刺组织特异性分布的分子调控过程中起着重要作用。

目录

声明

摘要

符号说明

1．1 遗传连锁图谱的构建

1．1．1 遗传图谱构建的基本原理

1．1．2 作图群体

1．1．3 遗传标记

1．1．4 SSR分子标记

1．1．5 白菜类作物遗传图谱的构建

1．2 数量性状的QTL定位

1．2．1 QTL作图原理及方法

1．2．2 QTL作图软件

1．2．3 白菜类作物的QTL定位

1．3 植物表皮毛相关研究进展

1．3．1 植物表皮毛的形态结构及功能

1．3．2 植物表皮毛发育的分子调控机制

1．3．3 白菜类作物表皮毛相关研究进展

1．4 本项研究的目的与意义

第2章 大白菜产量相关性状的QTL定位与分析

2．1 引言

2．2．2 田问性状调查

2．2．3 数据统计及分析

2．2．4 EST-SSR引物序来源及引物设计

2．2．5 基因组DNA的提取

2．2．6 EST-SSR的检测

2．2．7 遗传连锁分析与图谱构建

2．2．8 QTL定位

2．3 结果与分析

2．4 讨论

2．5 小结

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 大白菜叶片毛刺基因的精细定位

3．2．2 候选基因的克隆与分析

3．2．3 候选基因的序列分析及验证

3．2．5 候选基因的表达模式分析

3．3 结果与分析

3．3．1 遗传分析

3．3．2 大白菜叶片毛刺基因的精细定位

3．3．3 候选基因的序列分析

3．3．4 分子标记的开发及连锁分析

3．3．5 BraGL1基因的表达模式分析

3．3．6 分子标记的验证与应用

3．3．7 BraTTG1的克隆及表达模式分析

3．4 讨论

3．4．1 大白菜叶片毛刺基因的精细定位

3．4．2 候选基因的序列分析

3．4．4 分子标记的应用

3．5 小结

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 试验材料及表型鉴定

4．2．2 总RNA提取

4．2．3 基因表达谱的生物信息学分析

4．3 结果与分析

4．3．1 高通量测序数据及质量分析

4．3．2 Clean reads与参考基因组和参考基因的比对情况分析

4．3．3 大白菜不同叶片组织的基因表达模式分析

4．3．4 大白菜不同叶片组织的差异表达基因(DEGs)分析

4．3．5 DEGs的GO功能分类和KEGG pathway富集分析

4．3．6 大白菜叶片毛刺发育相关基因的挖掘

4．4 讨论

4．4．1 参与大白菜叶片毛刺发生的差异表达基因

4．4．2 参与乙烯信号调控叶片毛刺发育的差异表达基因

4．4．3 参与植物激素信号转导通路的差异表达基因

4．5 小结

第5章 结论

附录

参考文献

致谢

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