Plectin通过抑制integrin α6β4/FAK/p38MAPK通路减轻阿霉素诱导的足细胞凋亡及F-actin细胞骨架紊乱

摘要

目的:
　　1.明确在阿霉素诱导的足细胞凋亡及F-actin细胞骨架紊乱中plectin蛋白的变化情况及作用。
　　2.探讨阿霉素诱导的足细胞凋亡及F-actin细胞骨架紊乱中涉及到plectin蛋白的相关信号通路及其引起足细胞损伤的作用机制。
　　3.观察阿霉素肾病动物模型中肾小球足细胞形态和数量的改变，plectin及下游信号通路蛋白的表达变化情况。
　　方法:
　　1.细胞培养:体外培养永生化小鼠足细胞系。使用Ⅰ型胶原蛋白包被的细胞培养皿，将足细胞置入含有10％胎牛血清的RPMI1640+100U/ml青霉素+100mg/ml链霉素+10U/ml重组小鼠γ-干扰素中，于33℃下培养足细胞增殖。后将足细胞转移到37℃条件下，在不含有重组小鼠γ-干扰素的培养基中继续培养14天，足细胞分化成熟。
　　2.建立阿霉素肾病大鼠模型:购买雄性Sprague-Dawley大鼠20只(200g±20g)，大鼠被安置在温度控制的房间，自然光线照明，循昼夜规律，通风良好，并提供可以自由获得的食物和水，将这些大鼠随机分为两组（n=10，每组）:阿霉素组和正常对照组。阿霉素组通过尾静脉单次注射7.5mg/kg的阿霉素来建立肾病模型大鼠，正常对照组注射同剂量的生理盐水，实验期间没有大鼠死亡。注射后第4周结束饲养并将大鼠安乐死，处死前记录体重，利用代谢笼收集每只大鼠的24小时尿液，以测定24小时尿量和24小时尿蛋白，从腹主动脉收集血液，离心制备血清，-20℃保存。
　　3.检测阿霉素刺激足细胞后plectin蛋白的表达、ROS的水平以及足细胞损伤指标的变化:(1)western blot、实时定量PCR和流式细胞术检测在不同阿霉素浓度和干预时间点下足细胞中plectin蛋白的表达情况以及ROS的水平，并确定特定的阿霉素浓度和干预时间来进行后续的细胞分子实验;(2)鬼笔环肽-荧光素染色实验观察阿霉素刺激足细胞后F-actin细胞骨架结构的改变;(3)流式细胞术检测阿霉素诱导的足细胞凋亡情况;(4)western blot实验检测阿霉素干预的足细胞中损伤标志物蛋白WT1、synaptopodin和desmin的表达水平;(5)western blot和流式细胞术检测应用线粒体保护剂后阿霉素刺激的足细胞中ROS水平和plectin蛋白的表达情况;
　　4.检测plectin蛋白在阿霉素诱导的足细胞损伤中的作用:(1)利用包含plectin cDNA的质粒转染足细胞，以使阿霉素刺激的足细胞中plectin表达上调至正常水平，进而利用流式细胞术、细胞免疫荧光染色和western blot技术检测足细胞凋亡率变化情况、足细胞F-actin细胞骨架变化以及足细胞特异性标志物蛋白WT1、synaptopodin和desmin的变化情况;(2)plectin特异性小干扰RNA(siPlectin)转染足细胞后，利用流式细胞术、细胞免疫荧光染色和western blot技术检测足细胞凋亡率变化情况、足细胞F-actin细胞骨架变化以及足细胞特异性标志物蛋白WT1、synaptopodin和desmin的变化情况。
　　5.检测plectin蛋白调控的相关信号传导通路及其在足细胞损伤中的作用机制:(1)western blot实验检测阿霉素诱导的足细胞损伤中integrinα6β4、FAK和p38总蛋白表达量以及磷酸化水平;应用siPlectin后足细胞中integrinα6β4、FAK和p38的总蛋白表达量、磷酸化水平。(2)western blot实验检测在阿霉素诱导的足细胞中通过质粒转染技术恢复plectin表达后，integrinα6β4、FAK和p38的表达量和磷酸化水平的变化情况。(3)western blot实验和流式细胞术检测在应用siPlectin后足细胞中integrinα6β4、FAK和p38的表达量、磷酸化水平以及细胞凋亡率的时间-过程效应。(4)western blot实验检测在转染Y1494位点突变的integrinα6β4后再给予siPlectin，FAK和p38表达量与磷酸化水平、足细胞的凋亡率、细胞骨架变化情况以及损伤标志物蛋白WT1、synaptopodin和desmin的表达量变化情况。(5)western blot实验、流式细胞术和免疫荧光染色检测应用FAK的Y397位点抑制剂后再给予siPlectin，integrinα6β4和p38的表达量与磷酸化水平、足细胞的凋亡率、细胞骨架变化情况以及损伤标志物蛋白WT1、synaptopodin和desmin的表达量。(6)western blot实验、流式细胞术和免疫荧光染色检测应用p38特异性抑制剂后再给予siPlectin，integrinα6β4和FAK的表达量与磷酸化水平、凋亡蛋白Bax和caspase-3表达量、细胞骨架调节子synaptopodin表达量、细胞凋亡率以及细胞骨架变化。
　　结果:
　　1.0.5μg/ml的阿霉素干预足细胞12小时后，可见足细胞的F-actin细胞骨架结构紊乱，向外周崩塌，足细胞凋亡率也较正常对照组明显升高(P＜0.01)。另外，足细胞经典的标志物蛋白WT1和synaptopodin较正常对照组明显减少(P＜0.01)，足细胞损伤标志蛋白desmin较正常对照组明显增多(P＜0.01)。
　　2.0.5μg/ml的阿霉素干预足细胞1小时、2小时、4小时、6小时及12小时后，线粒体氧化应激产生的ROS均明显升高(P＜0.01)，但plectin表达量在4-6小时期间才明显升高(P＜0.05)，足细胞凋亡率也在4-6小时期间才明显升高(P＜0.05)，应用线粒体保护剂后，plectin蛋白表达量较单纯阿霉素干预组明显恢复(P＜0.01)。将转染plectin cDNA质粒的阿霉素干预组与单纯阿霉素干预组相比，足细胞的凋亡率明显下降(P＜0.01)，F-actin细胞骨架紊乱程度减轻，WT1和synaptopodin的表达量明显升高(P＜0.01)，desmin的表达量明显下降(P＜0.01)。而转染siPlectin的正常足细胞则出现严重的细胞凋亡和细胞骨架紊乱，WT1和synaptopodin的表达量明显下降(P＜0.01)，desmin的表达量明显增加(P＜0.01)。
　　3.阿霉素干预足细胞可引起细胞内integrinα6β4、FAK和p38的磷酸化水平明显升高(P＜0.01)，而对阿霉素干预的足细胞转染plectin cDNA质粒，可抑制integrinα6β4、FAK和p38的磷酸化水平升高并减轻细胞损伤，对正常足细胞转染siPlectin则能模拟出阿霉素引起的integrinα6β4、FAK和p38磷酸化水平升高(P＜0.01)。对足细胞转染siPlectin的时间-过程效应实验则显示出integrinα6β4、FAK和p38的磷酸化水平依次升高，足细胞凋亡率也随着p38磷酸化水平升高而增加。转染integrinβ4Y1494位点突变的质粒能阻止siPlectin引起的FAK和p38磷酸化水平升高;给予FAK抑制剂能阻止siPlectin引起的p38磷酸化水平升高，但不会影响integrinα6β4磷酸化水平升高;给予p38抑制剂则不能阻止siPlectin引起的integrinα6β4和FAK磷酸化水平升高，但是可以抑制由siPlectin引起的Bax和caspase-3蛋白表达。FAK和p38抑制剂均可改善由siPlectin引起的WT1、synaptopodin和desmin蛋白表达异常。
　　4.大鼠尾静脉注射阿霉素后，肾小球萎缩和丢失，肾小球系膜细胞增殖和肾小球系膜基质沉积增加，足突融合。与正常对照组足细胞相比，特异性标志物蛋白WT1和synaptopodin表达减少(P＜0.01)，损伤标志蛋白desmin表达增加(P＜0.01)，凋亡标志物蛋白Bax和caspase-3表达增加(P＜0.01)，信号通路蛋白integrinα6β4、FAK和p38的磷酸化水平升高(P＜0.01)。
　　结论:
　　1.阿霉素通过线粒体氧化应激来抑制plectin蛋白表达，plectin蛋白表达的减低在阿霉素引起的足细胞凋亡率增加和细胞骨架紊乱中发挥关键作用。
　　2.Plectin蛋白表达的减少激活了integrinα6β4/FAK/p38MAPK信号传导通路，信号通路蛋白的磷酸化水平升高，通路靶蛋白中的凋亡调节蛋白Bax和caspase-3表达增加，细胞凋亡增多;通路靶蛋白中的细胞骨架调节子synaptopodin表达减少，细胞骨架紊乱。
　　3.阿霉素肾病大鼠模型中可观察到肾小球基底膜病理改变和足细胞形态异常，plectin蛋白减少，Bax和caspase-3蛋白增多，integrin cα6β4、FAK和p38MAPK蛋白磷酸化水平升高，与体外实验的结果相一致。

目录

声明

摘要

中英文缩写对照表

第一章 绪论

第二章 资料和方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

第三章 结果及结论

3．1 ADR诱导足细胞损伤并使plectin蛋白表达下调

3．2 ADR通过线粒体氧化应激下调plectin的表达

3．3 恢复plectin蛋白表达可显著减轻ADR诱导的足细胞损伤

3．4 抑制plectin蛋白表达可模拟出ADR诱导的足细胞损伤

3．5 Plectin蛋白表达沉默可导致integrin α6β4、FAK和p38激活

3．7 Integrin α6β4的Y1494位点的磷酸化介导了FAK和p38活化

3．8 FAK的Y397位点磷酸化促进了p38的活化

3．10 ADR肾病模型大鼠肾脏组织中plectin表达减低，并伴随integrin α6β4、FAK和p38蛋白磷酸化水平升高

第四章 讨论

附图表

参考文献

致谢

攻读博士学位期间发表文章情况

学位论文评阅及答辩情况表

英文论著一

英文论著二