IFITM1基因在小鼠卵泡发育与排卵过程中的功能及相关调控机制研究

摘要

从卵泡发育到排卵需经过十分复杂的生理过程，此过程受内分泌激素、免疫调节和代谢信号等多种复杂因素共同调节。目前其相关过程的分子机制研究仍然比较有限。课题组前期对大白猪和太湖猪的排卵前卵泡组织进行了转录组测序，鉴定出2675个差异表达的基因。其中干扰素诱导的跨膜蛋白1(Interferon-induced transmembrane protein1，IFITM1)在两个猪种间表达差异极显著，差异表达倍数为3.174。故本研究以IFITM1基因为研究对象，以小鼠卵巢颗粒细胞为研究模型，利用RNAi和超表达等方法，通过细胞原代培养、转染、qRT-PCR、Western blot、ELISA、EDU染色、MTT实验、CCK-8实验和流式细胞术等技术，研究IFITM1基因在卵泡发育与排卵中的功能及相关分子调控机制。主要研究结果如下:
　　1.IFITM1基因在卵泡排卵过程中的作用
　　(1)IFITM1基因影响排卵标记基因表达及分子机制
　　在小鼠卵巢颗粒细胞(mouse granulosa cells，mGCs)中，通过qRT-PCR和Western blot等方法表明干扰IFITM1基因的表达可以显著促进排卵标记基因LHR、AREG、EREG和Cyp19a1的表达;补偿实验表明，过表达IFITM1基因能显著抑制排卵标记基因LHR和Cyp19a1的表达。在mGCs中，加入3种调控卵泡发育或排卵的重要细胞信号通路(ERK1/2、TGF-β和PI3K/AKT)的抑制剂阻断相应的细胞信号通路后检测排卵相关标记基因。qRT-PCR结果显示，阻断ERK1/2或TGF-β细胞信号通路后抑制表达IFITM1基因，排卵标记基因EREG、LHR的mRNA水平仍有显著上升;阻断PI3K/AKT信号通路后抑制表达IFITM1基因，排卵标记基因LHR、Cyp19a1和EREG的mRNA水平则未出现明显改变。同时Western blot结果显示，抑制表达IFITM1基因后，PI3K/AKT信号通路上关键蛋白p-AKT(Ser473)的蛋白质水平显著降低。
　　以上结果表明，IFITM1基因通过PI3K/AKT细胞信号通路活性影响排卵标记基因的表达。
　　(2)IFITM1基因影响卵巢颗粒细胞分泌孕酮
　　在mGCs中，超表达或抑制表达IFITM1基因后运用qRT-PCR方法检测孕酮及其受体合成关键基因的表达水平。结果显示，超表达IFITM1基因，孕酮受体基因PGR的mRNA水平显著升高;抑制表达IFITM1基因，孕酮受体基因PGR的mRNA水平显著降低，孕酮合成关键基因3β-HSD，StAR mRNA表达水平显著升高。在mGCs中，转染pCMV-HA-IFITM1或siRNA-IFITM1后运用ELISA方法检测细胞上清中的孕酮的浓度，结果表明:超表达IFITM1基因，孕酮的浓度未出现明显变化，抑制表达IFITM1基因，显著降低孕酮的浓度。
　　以上结果表明，IFITM1基因能影响小鼠卵巢颗粒细胞分泌孕酮，并影响颗粒细胞孕酮受体的合成。
　　2.IFITM1基因影响卵巢颗粒细胞周期与细胞增殖
　　通过流式细胞术检测IFITM1基因对卵巢颗粒细胞周期的影响，结果显示，相比于对照组，超表达IFITM1基因后，卵巢颗粒细胞周期S期细胞比例显著降低，抑制表达IFITM1基因，卵巢颗粒细胞周期G0/G1期的细胞比例显著降低。qRT-PCR结果显示，超表达IFITM1基因，细胞周期蛋白CCNA2和CCND1mRNA的表达水平显著升高;抑制表达IFITM1基因，CCND1的mRNA水平显著降低。在颗粒细胞中，运用EDU染色实验、CCK-8实验和MTT实验来检测细胞增殖的变化。实验结果显示:与对照组相比，IFITM1的表达受到抑制，颗粒细胞增殖的比例显著降低。
　　综上所述，得出结论:(1)IFITM1基因影响卵巢颗粒细胞分泌孕酮，并通过影响PI3K/AKT信号通路活性影响卵泡排卵;(2)IFITM1基因通过调控细胞周期调控因子CCND1的表达影响卵巢颗粒细胞周期;IFITM1基因能调节卵巢颗粒细胞增殖。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略词表

1 前言

1．1 研究问题的由来

1．2 卵泡发育和排卵过程及其调控

1．3 卵巢颗粒细胞与卵泡发育

1．3．2 卵巢颗粒细胞凋亡与卵泡闭锁

1．4 卵泡发育和排卵过程相关细胞信号通路研究进展

1．4．2 ERK1／2

1．4．3 PI3K／PTEN／AKT

1．5 排卵过程中关键基因

1．6 IFITM1基因研究进展及功能

1．6．2 IFITM1基因主要功能

1．7 目的与意义

2 实验材料

2．1 组织样品

2．2 实验动物

2．3 菌株、载体

2．4 主要仪器和设备

2．5 实验试剂、试剂盒与耗材

2．6 常用试剂及配制

2．7 生物信息学网站及分析软件

3 试验方法

3．1 细胞的分离、复苏、培养与冻存

3．1．1 小鼠卵巢颗粒细胞的分离

3．1．2 细胞的复苏

3．1．3 细胞的培养

3．1．4 细胞的冻存

3．2 细胞的转染

3．2．1 siRNA的转染

3．2．3 质粒的转染

3．3 通路抑制剂处理

3．4 细胞总RNA提取

3．5 cDNA的制备

3．6 实时荧光定量PCR检测基因mRNA的表达水平

3．7 细胞总蛋白提取

3．8 蛋白浓度的测定

3．9 Western blot

3．10 基因真核表达载体的构建

3．11 RNAi

3．12 细胞增殖检测方法

3．12．2 EDU法检测细胞增殖

3．12．3 CCK8法检测细胞增殖

3．13 流式细胞仪检测细胞周期

3．14 ELISA分析

3．15 数据分析

4 结果与分析

4．2．1 卵巢颗粒细胞中超表达、抑制表达IFITM1基因

4．2．2 IFITM1基因对排卵标记基因的影响

4．3 IFITM1基因影响排卵标记基因表达的机制

4．4 IFITM1基因对卵巢颗粒细胞分泌孕酮的影响

4．5 IFITM1基因对卵巢颗粒细胞生长的影响

4．5．1 IFITM1基因对箩日巢颗粒细胞周期的影响

4．5．2 IFITM1基因对卵巢颗粒细胞增殖的影响

5 讨论

5．2 IFITM1基因与卵巢颗粒细胞生长

5．3 IFITM1基因与PI3K／AKT信号通路

6 全文结论

7．1 创新之处

7．2 不足之处

参考文献

致谢