结核分枝杆菌检测方法的初探及其与宿主互作蛋白的筛选

摘要

结核病(Tuberculosis)是一种古老的慢性消耗性人兽共患传染病，主要由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)引起。结核病不仅造成巨大的经济损失，还严重危害着人类的健康。结核分枝杆菌在宿主细胞寄生过程中会分泌一些蛋白，然而这些分泌蛋白的作用机制并不清楚，探讨这些分泌蛋白在结核分枝杆菌致病的过程中的作用机制，能够为新的结核疫苗研发提供理论基础。另外，我国结核病的状况十分严峻，传统的检测方法已经不能满足临床需求，此种状况同样存在于我国牛场。本实验针对结核病的诊断方法及疫苗研发的分子机制这两个方面展开研究:
　　1.利用CRISPR/Cas9的系统构建稳定表达ESAT6，MPT64和串联亲和层析标签ZZtag-3×Flag的三个Raw264.7细胞系。成功扩增如下片段:Neomycin、ZZtag、TEV剪切酶识别位点，3×Flag，mCherry以及重组同源臂Arm1和Arm2，经过多次重叠PCR成功融合这7个片段后获得串联亲和层析用重组载体命名为pMD18T-TAP。本实验成功构建用于串联亲和层析的6个重组质粒pMD18T-TAP、pMD18T-TAP-ESAT6、pMD18T-TAP-CFP10、pMD18T-TAP-HspX、pMD18T-TAP-MPT64和pMD18T-TAP-Ag85B，利用CRISPR/Cas9系统分别构建稳定表达结核分枝杆菌分泌蛋白(ESAT6、MPT64)以及串联亲和层析标签组合ZZtag-3×Flag的Raw264.7细胞系，然后利用串联亲和层析联用质谱的方法成功筛选出与ESAT6互作的宿主蛋白为Serine/arginine repetitive matrix protein1，后续将验证ESAT6与Serine/arginine repetitive matrix protein1的互作。
　　2.本实验初步建立能在实验室检测结核分枝杆菌H37Ra的三种方法:TB-LAMP、MDA-PCR以及HCR。实验选取IS6110基因为靶基因，发现TB-LAMP、MDA-PCR能在几十个结核分枝杆菌H37Ra存在时扩增出阳性，且比直接菌液PCR扩增的灵敏度高一个数量级。本实验首次尝试改进传统HCR的方法将其用于结核分枝杆菌H37Ra的检测，得到阳性结果，且靶定三个基因(IS6110，CFP10，GryB)时，提高了HCR方法检测的检出率。本实验研究建立了TB-LAMP、MDA-PCR以及HCR这三个方法，能够用于结核分枝杆菌H37Ra的基因IS6110的检测，并且首次将MDA-PCR和HCR的方法用于结核分枝杆菌H37Ra的检测。

目录

声明

摘要

缩略词表

1．1．1 结核病简介及现状

1．1．2 结核分枝杆菌病原特性

1．1．3 结核病的发病机制

1．1．4 结核分枝杆菌与巨噬细胞的互作

1．1．5 结核分枝杆菌的致病性

1．1．6 与结核分枝杆菌毒力有关的一些抗原

1．2 蛋白互作组学及主要研究手段

1．2．1 串联亲和层析简介

1．3 CRISPR／Cas9基因编辑系统

1．3．1 CRISPR／Cas9概述

1．3．2 CRISPR／Cas9技术的应用

1．4 结核病诊断

1．4．1 结核病的诊断技术研究进展

1．4．2 结核病的临床诊断

1．4．3 结核病的实验室诊断方法

2．1 实验材料

2．1．1 细胞系，菌株，质粒

2．1．2 主要药品与试剂

2．1．3 主要培养基、抗生素及其配置

2．1．4 缓冲液及其配置

2．1．5 主要的生物学分子软件

2．2 实验方法

2．2．1 常规分子克隆实验

2．2．2 稳定表达分泌蛋白Raw264.7细胞系的构建

2．2．3 串联亲和纯化(Tandem Affinity Purification)

2．2．4 银染

2．2．5 结核分枝杆菌环介导等温扩增实验检测方法的建立

2．3 实验用引物

第三章 实验结果

3．2 稳定表达ESAT6／CFP10／Ag85B／HspX／MPT64的Raw264.7细胞系的构建及鉴定

3．2．1 G418工作浓度的筛选

3．2．2 稳定表达分泌蛋白的Raw264.7细胞系的构建

3．2．3 间接免疫荧光鉴定改造后细胞系目的蛋白的表达

3．2．4 流式细胞仪筛选阳性细胞

3．2．5 检测重组片段成功插入Raw264.7基因组Hipp11位点

3．2．6 Western Blot检测稳定表达分泌蛋白的细胞系的蛋白表达

3．3 串联亲和层析方法筛选与ESAT6或MPT64互作的宿主蛋白

3．4 TB-LAMP检测结核分枝杆菌H37Ra的方法的建立

3．4．1 LAMP方法阳性质粒的构建

3．4．2 LAMP检测结核分枝杆菌H37Ra实验的建立

3．5 MDA-PCR方法检测结核分枝杆菌H37Ra的实验的建立

3．6 HCR鉴定结核分枝杆菌的方法建立

第四章 讨论

4．1 筛选与结核分枝杆菌分泌蛋白互作的宿主蛋白

4．2 结核分枝杆菌H37Ra检测方法的初步建立

第五章 结论

参考文献

致谢