蓝藻藻蓝胆素及其蛋白质的生物工程鉴定

摘要

藻胆蛋白是蓝藻中的捕光蛋白，其生物合成的重要一步是藻胆色素与脱辅基蛋白的连接。大多数藻胆色素的正确连接都需要结合位点专一和对色素的构象有选择性的裂合酶来催化完成,但是这方面的报道不是很多。本实验室通过同源性分析获得的由编号为alr0617基因编码的蛋白为b-CPC、b-PEC中的Cys-84，a-APC和b-APC中的Cys-82与PCB的连接的催化酶，命名为藻蓝蛋白裂合酶CpeS。 设计引物通过PCR技术从藻总DNA中扩增藻蓝蛋白b亚基基因cpcB,其编码的蛋白CpcB在CpeS催化下与PCB进行体外重组，找到CpcB的最佳表达条件：温度 35°C，时间 6h,LB培养基。 CpeS存在的情况下，通过体内重组方式得到色素蛋白PCB-b-CPC和PCB-b-PEC，但是却得不到色素蛋白PCB-b-PEC（C84S）；没有CpeS存在的情况下，只有11.8％的PCB-b-CPC和6％的PCB-b-PEC生成。这些结果表明：藻蓝蛋白裂合酶起到了催化PCB与Cys-84连接的作用。 构建CpeS（H22V）突变体，通过体内重组的方式研究了组氨酸残基突变对CpeS酶活性的影响，结果表明该残基对于CpeS的酶活性具有一定的影响,其活性为野生型CpeS酶活性的14.5％。使用胃蛋白酶对天然色素蛋白b-CPC、b-PEC和APC以及重组色素蛋白PCB-CpcB(C155I)、PCB-PecB（C155I）、PCB-a-APC和PCB-b-APC进行相同条件的水解并得到各自的色素肽。酸性尿素变性实验证明得到的色素肽中的PCB没有被破坏。色素肽的高效液相色谱分析结果表明：藻蓝蛋白裂合酶CpeS催化PCB与b-CPC和b-PEC中Cys-84的连接；APC由a-APC和b-APC中构成，CpeS催化PCB与a-APC和b-APC中Cys-82的连接。