胆管癌表遗传学研究DNMTi与HDACi对胆管癌细胞干预效应的研究

摘要

胆管癌是一种恶性程度很高的肿瘤性疾病，早期无特异性诊断标准，诊断明确时多已是晚期，已失去了手术时机；且目前临床常用化疗药物对胆管癌均疗效较差。
　　 本研究为进一步明确组蛋白脱乙酰化酶抑制剂与DNA 甲基化酶抑制剂联合作用机制、明确表遗传学变化间的关系奠定了基础，并为利用表遗传学方法治疗胆管癌提供了实验依据。
　　 第一部分：DNMTi与HDACi对胆管癌细胞的干预效应
　　 论文1. DNMTi与HDACi对胆管癌细胞中抑癌基因表达的影响
　　 目的：研究肼屈嗪与丙戊酸联合作用对于体外胆管癌细胞QBC939中P16、RASSF1A、E-Cadherin等抑癌基因mRNA 及蛋白表达，以及启动子区甲基化状态的影响。
　　 方法：将胆管细胞QBC939 分为空白组、单用丙戊酸组、单用肼屈嗪组与两药合用组，相应给予丙戊酸、肼屈嗪以及两药联用，空白组给予等量RPIM-1640 培养液，干预48h后，RT-PCR、Western-blot法检测各组细胞中P16、RASSF1A、E-Cadherin基因mRNA 及其蛋白表达；MSP法检测各组细胞中P16、RASSF1A、E-Cadherin基因启动子区甲基化状态。
　　 结果：1.空白组胆管癌细胞QBC939中P16基因表达量极低，RASSF1A与E-Cadherin基因均未见表达；单用丙戊酸组细胞中P16、RASSF1A 及E-Cadherin基因表达量与其空白组一致；单用肼屈嗪组细胞中P16、RASSF1A 及E-Cadherin基因表达量较空白组及单用丙戊酸组增多；两药联用组细胞中P16、RASSF1A 及E-Cadherin基因表达量较其它三组明显增高。2. 空白组中胆管癌细胞QBC939P16 蛋白表达量极低，未见RASSF1A与E-Cadherin 蛋白表达；单用丙戊酸组细胞三种蛋白表达量与其空白组一致；单用肼屈嗪组细胞中三种蛋白表达量较空白组和单用丙戊酸组增多；两药联用组细胞中P16、RASSF1A 及E-Cadherin 蛋白表达量较其余三组明显增高。3. 空白组胆管癌细胞QBC939中，P16基因启动子区呈部分去甲基化；RASSF1A、E-Cadherin基因启动子区超甲基化；单用丙戊酸组细胞RASSF1A、E-Cadherin基因启动子区仍呈超甲基化状态，P16基因启动子区仍呈部分去甲基化状态；单用肼屈嗪组细胞中三种基因启动子区均呈部分去甲基化状态；两药联组细胞中三种抑癌基因启动子区呈完全去甲基化状态。
　　 结论：肼屈嗪与丙戊酸两药合用可诱导胆管癌细胞QBC939中P16、RASSF1A、E-Cadherin 三种抑癌基因启动子区完全去甲基化，并可促进三种基因mRNA 及其蛋白大量恢复表达；而单用一种药物效果明显弱于两药合用。
　　 论文2. DNMTi与HDACi对胆管癌细胞生长与侵袭转移力的影响
　　 目的：探讨肼屈嗪与丙戊酸联合作用对于体外胆管癌细胞QBC939 生长与侵袭转移力的影响。
　　 方法：将胆管细胞QBC939 分为空白组、单用丙戊酸组、单用肼屈嗪组与两药合用组，相应给予丙戊酸、肼屈嗪以及两药联用，空白组给予等量RPIM-1640 培养液，48h后1. 流式细胞术Annexin/PI Ⅴ双标法检测各组细胞的凋亡情况；2. Transwell法检测各组细胞侵袭转移力；
　　 结果：1.空白组细胞凋亡率为(2.855±0.936)%，单用丙戊酸组细胞凋亡率为(11.56±1.590)%，单用肼屈嗪组细胞凋亡率为(24.65±2.330)%；两药合用组细胞凋亡率为(47.93±3.973)%。两药合用组凋亡细胞较单用药组调亡细胞数量明显增多(P<0.01)。2.计数移至微孔下层的细胞，结果显示空白组细胞侵袭转移力最强(P<0.01)；肼屈嗪与丙戊酸联合作用组细胞侵袭转移力最弱(P<0.01)；肼屈嗪组细胞侵袭转移力较丙戊酸组弱(P<0.01)。
　　 结论：单用肼屈嗪与单用丙戊酸均可引起体外胆管癌细胞QBC939不同程度凋亡；但两药合用致使细胞凋亡数量远多于单用一种药物；单用肼屈嗪与单用丙戊酸均可引起体外胆管癌细胞QBC939 侵袭转移力不同程度减弱，但两药合用效果明显强于单用一种药物。表明两药合用在致细胞凋亡及降低胆管癌细胞QBC939 侵袭转移力方面有增效作用。
　　 第二部分：DNMTi与HDACi对胆管癌细胞中SIRT1基因表达的调节
　　 论文3. DNMTi与HDACi 通过恢复胆管癌细胞中HIC1基因表达抑制SIRT1基因表达
　　 目的：探讨肼屈嗪与丙戊酸对胆管癌细胞QBC939中SIRT1基因表达的影响及调节机制。
　　 方法：将正常胆管上皮细胞HIBEC-HR和胆管癌细胞QBC939 均分别分为空白组、单用丙戊酸组、单用肼屈嗪组及两药合用组，相应给予丙戊酸、肼屈嗪以及两药联用，空白组给予等量RPIM-1640 培养液，干预48h后，RT-PCR、Westen blot法检测各组胆管癌细胞QBC939中SIRT1、HIC1基因mRNA 及其蛋白表达；RT-PCR法检测各组正常胆管上皮细胞HIBEC-HR中SIRT1基因mRNA 及其蛋白表达；构建含HIC1基因干扰片段质粒，将胆管癌细胞QBC939 分为两药合用组、两药合用＋阴性对照组、两药合用＋干扰质粒组，两药合用＋阴性对照组与两药合用＋干扰质粒组内分别转染阴性质粒和干扰质粒，两药合用组转染液中不含质粒，转染完成后以两药联用干预各组细胞，48h后，RT-PCR、Wes t enblot法检测干扰HIC1基因后两药联用对SIRT1基因mRNA 及其蛋白表达的影响.
　　 结果：1. 空白组、单用肼屈嗪组与单用丙戊酸组胆管癌细胞QBC939间SIRT1基因及其蛋白表达无统计学差异(P>0.05)，两药联用组胆管癌细胞QBC939内SIRT1基因及蛋白的表达较其余三组明显降低(P<0.01)；两药联用组内HIC1基因及其蛋白表达较单用药组以及空白组明显增高(P<0.01)，空白组与单用丙戊酸组内无HIC1基因及其蛋白表达，单用肼屈嗪组中可见HIC1基因及蛋白的少量表达。
　　 2.干预后各组间正常胆管上皮细胞HIBEC-HR内SIRT1基因及蛋白表达无统计学差异(P>0.05)。
　　 3. 抑制HIC1基因表达后，两药合用＋干扰质粒组内细胞SIRT1基因及其蛋白表达较两药合用组和两药合用＋阴性质粒组明显增强(P<0.01)，而后两组间SIRT1表达无统计学差异(P>0.05)。
　　 结论：肼屈嗪与丙戊酸联合作用通过上调HIC1基因表达降低胆管癌细胞QBC939内SIRT1基因表达。
　　 第三部分：DNMTi与HDACi 联合作用抑制胆管癌细胞中SIRT1表达恢复RASSF1A基因表达
　　 论文4. DNMTi与HDACi 联合作用抑制胆管癌细胞中SIRT1表达恢复RASSF1A基因表达
　　 目的：探讨SIRT1 在肼屈嗪与丙戊酸联合恢复胆管癌细胞QBC939RASSF1A基因表达中的作用。
　　 方法：成功构建含HIC1基因干扰片段质粒，将培养的胆管癌细胞QBC939 分为：两药合用组（H+V组）；两药合用＋阴性对照组（H+V+pHK组）；两药合用＋干扰质粒组，两药合用＋阴性对照组与两药合用＋干扰质粒组内分别转染阴性质粒和干扰质粒，两药合用组转染液中不含质粒，转染完成后以两药联用干预各组细胞，48h后，RT-PCR、Western blot法检测各组细胞中RASSF1A基因及其蛋白表达；另取胆管癌细胞分为两组，分别为：两药合用＋干扰质粒组（H+V+pSihHIC1-2组）和两药合用＋干扰质粒＋烟酰胺组（H+V+pSihHIC1-2+NAM组），转染含HIC1基因干扰片段质粒成功后给予相应药物干预48h后，RT-PCR、Western blot法检测各组细胞中RASSF1A基因mRNA 及其蛋白表达；MSP法检测各组细胞中RASSF1A基因启动子区甲基化状态；
　　 结果：1. RT-PCR结果显示，两药合用组与两药合用＋阴性对照组中RASSF1A基因mRNA表达较两药合用＋干扰质粒组强（P<0.01)；Western blot结果与RT-PCR一致，两药合用组与两药合用＋阴性对照组中RASSF1A 蛋白表达较两药合用＋干扰质粒组高（P<0.01)，MSP结果显示，三组细胞RASSF1A基因启动子区甲基化状态一致，都呈完全去甲基化状态。2. RT-PCR结果显示，两药合用＋干扰质粒组中RASSF1A基因mRNA表达较两药合用＋干扰质粒＋烟酰胺组明显减弱（P<0.01)；Western blot结果显示两药合用＋干扰质粒组中RASSF1A 蛋白表达较两药合用＋干扰质粒＋烟酰胺组明显减弱（P<0.01)。3. 各组细胞中RASSF1A基因启动子区均呈去甲基化状态.
　　 结论：SIRT1 参与了肼屈嗪与丙戊酸恢复胆管癌细胞QBC939中抑癌基因RASSF1A表达的过程；恢复HIC1表达继而抑制SIRT1表达，是肼屈嗪与丙戊酸恢复胆管癌细胞QBC939中抑癌基因RASSF1A表达的机制之一。SIRT1表达改变对抑癌基因启动子区甲基化状态无影响。