永生化骨骺干细胞株的建立及PTHrP亚基因对骨骺干细胞增殖和分化的影响

摘要

目的：体外分离、培养、鉴定骨骺干细胞并诱导其永生化，建立高水平诱导、低背景表达的骨骺干细胞株，研究甲状旁腺相关蛋白亚基因PTHrP(1-36)、PTHrP(38-94)和PTHrP(107-139)对体外培养的骨骺干细胞的调控作用以及PTHrP(107-139)与其他调控因子的相互影响。
　　 方法：采用显微取材和免疫磁性分选技术分离纯化具有成纤维生长因子受体-3（fibroblast growth factor receptor-3，FGFR-3）特异性表面标志的骨骺干细胞。利用电穿孔转染技术将含有猿肾病毒40大T抗原基因（SV40Tag）的质粒pCMVSV40T/PUR转染骨骺干细胞，经嘌呤霉素筛选，抗性克隆扩大培养获得永生化骨骺干细胞。提取骨骺干细胞的总RNA，以RT-PCR方法获得带有酶切位点的PTHrP(1-36)、PTHrP(38-94)和PTHrP(107-139)基因片段，扩增的DNA片段分别与载体pTRE-2Hyg双酶切后连接，转化扩增后对重组质粒进行提取和酶切、测序鉴定。用脂质体介导的基因转染技术将pTet-on质粒转染于骨骺干细胞，G418筛选得到稳定克隆，再瞬时转染pTRE-2Hyg-Luc质粒并筛选出高水平诱导、低背景表达的pTet-on骨骺干细胞系。用脂质体介导的基因转染技术将将质粒pTRE-PTHrP(1-36)、pTRE-PTHrP(38-94)和pTRE-PTHrP(107-139)分别转染高水平诱导、低背景表达的-pTet-on骨骺干细胞株，放入诱导分化培养基中进行培养，加入强力霉素进行诱导，以RT-PCR的方法检测PCNA基因的表达变化。应用RT-PCR的方法检测不同浓度的强力霉素下质粒pTRE-PTHrP(107-139)转染组的ColⅡ、Col Ⅹ、Ihh、Ptc、Sox9、BMP6基因的表达变化。
　　 结果：经免疫细胞化学证实所取材分离并纯化的细胞为骨骺干细胞。SV40Tag稳定转染入骨骺干细胞经扩大培养，命名为永生化骨骺干细胞。从骨骺干细胞中克隆出的PTHrP亚克隆基因PTHrP(1-36)、PTHrP(38-94)和PTHrP(107-139)经酶切图谱分析和DNA序列测定证实已经插入重组质粒pTRE-PTHrP(1-36)、pTRE-PTHrP(38-94)和pTRE-PTHrP(107-139)。pTet-on质粒转染于骨骺干细胞，并瞬时转染pTRE-2Hyg-Luc质粒获得1株诱导后荧光素酶的表达活性增加50倍的pTet-on骨骺干细胞株。强力霉素诱导的质粒pTRE-PTHrP(107-139)转染组的PCNA表达明显高于质粒pTRE-PTHrP(1-36)转染组和质粒pTRE-PTHrP(38-94)转染组；在强力霉素诱导的质粒pTRE-PTHrP(107-139)转染组中ColⅡ、Sox-9表达明显增强，Ihh表达未见明显变化，而 Ptc、Col Ⅹ、BMP6表达明显降低。而且其表达量与强力霉素存在剂量依赖性。
　　 结论：运用显微取材和免疫纯化技术可以成功分离纯化骨骺干细胞。经SV40Tag转染构建了永生化的骨骺干细胞株。成功克隆出PTHrP亚克隆基因PTHrP(1-36)、PTHrP(38-94)和PTHrP(107-139)并构建了反应质粒pTRE-PTHrP(1-36)、pTRE-PTHrP(38-94)和pTRE-PTHrP(107-139)。筛选得到的pTet-on骨骺干细胞株受强力霉素诱导后能够低背景、高水平表达。PTHrP(107-139)可能是通过调控Sox-9、Ptc、BMP6的表达来促进骨骺干细胞增殖并抑制其分化的，而PTHrP(1-36)、PTHrP(38-94)对PCSCs的增殖并无明显作用。pTet-on质粒系统在PCSCs能有效的调控外来基因的表达。