Notch和PTHrP双信号系统调控骨骺干细胞增殖与分化及其机制的初步研究

摘要

第一部分Notch信号系统对骨骺干细胞生长的调控作用 实验1骨骺干细胞的体外培养及生长特性观察 目的：探讨体外培养鼠骨骺干细胞及其生长特性观察，为其应用奠定基础。 方法：采用显微取材后酶消化获取骨骺干细胞，用Percoll密度梯度离心法纯化，并测定其细胞生长曲线、细胞分裂指数、碱性磷酸酶活性，用免疫组化及免疫荧光染色的方法检测Ⅱ、Ⅹ型胶原的合成情况和透射电镜观察粗面内质网的丰富程度。 结果：鼠骨骺干细胞形状类似成纤维细胞，呈梭型，碱性磷酸酶活性低，粗面内质网少，Ⅱ型胶原合成量较多。 结论：体外培养的骨骺干细胞能向成熟阶段分化，可为软骨或骨组织工程提供理想的种子细胞。 实验2Notch1信号系统对骨骺干细胞增殖与分化调控作用的初步观察 目的：研究激活的Notch1信号系统对体外培养的骨骺干细胞增殖与分化的调控作用。 方法：向体外培养的骨骺干细胞中分别加入Notch1激活剂rhNF-κB和抑制剂γ-secretaseinhibitorⅡ(MW167)，空白对照加PBS缓冲液。用RT-PCR、免疫组化、MTT、流式细胞仪、碱性磷酸酶染色和WesternBlot方法检测。 结果：骨骺干细胞中有Notch1和Jagged1表达；与对照组相比，rhNF-κB诱导组表达PCNA、CollagenⅡ蛋白明显增多，促细胞增殖作用明显(p=0.027)，并且进入分裂期(S期)细胞增多(26.54％)，而MW167诱导组碱性磷酸酶、CollagenⅩ蛋白表达明显增多，CollagenⅡ蛋白及分化标志蛋白stathmin表达明显减少。结论：当Notch信号系统被激活时，骨骺干细胞进行增殖；当Notch信号系统被抑制时，骨骺干细胞进行分化。 实验3激活的Notch1信号系统抑制骨骺干细胞凋亡及其机制研究 目的：研究激活的Notch1信号系统抑制体外培养的骨骺干细胞凋亡及其机制。 方法：用RT-PCR检测骨骺干细胞中Notch信号系统的表达，并分别向培养细胞中加入Notch1激活剂rhNF-kB、抑制剂γ-secretaseinhibitorⅡ(MW167)和Bcl-2抑制剂HA14-1，空白对照加PBS缓冲液，在凋亡诱导剂Celecoxib诱导后，用MTT检测细胞活力、流式细胞术检测细胞凋亡和WesternBlot检测Hes-1及Bcl-2蛋白的表达。 结果：骨骺干细胞中存在Notch1/Jagged1信号通路，rhNF-kB组细胞活力增加，凋亡较少，Hes-1蛋白和Bcl-2蛋白表达明显增加，而MW167组、HA14-1组和对照组细胞凋亡明显，差异有显著意义(p＜0.05)，且HA14-1组和HA14-1协同rhNF-kB组无Bcl-2表达。 结论：激活的Notch1信号系统通过促进靶基因Hes-1和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达来抑制骨骺干细胞凋亡。 实验4Notch信号系统对体外培养的鼠肢芽生长的调节作用 目的：研究Notch信号系统对体外培养器官生长的调节作用。 方法：体外培养孕16天鼠肢芽，通过测量其纵向生长长度、HE染色和甲苯胺蓝染色观察骨骺干细胞增殖与分化。 结果：与对照组相比，rhNF-κB实验组鼠肢芽纵向生长迟缓，MW167实验组纵向生长速度较快，差异有显著意义(p＜0.05)。rhNF-κB实验组表现出静止区骨骺干细胞明显增多，增殖区和肥大区成熟细胞所占比例较少；MW167实验组表现出骨骺干细胞明显处于分化状态，静止区骨骺干细胞非常少，增殖区和肥大区成熟软骨细胞所占比例明显增多。 结论：激活的Notch信号系统不仅对体外培养的骨骺干细胞增殖、分化有调节作用，而且对肢体内骨骺干细胞的增殖与分化也有调节作用。 第二部分Notch和PTHrP双信号系统的调控作用 实验5Notch和PTHrP双信号系统调节鼠骨骺干细胞增殖与分化及其机制研究 目的：研究Notch和PTHrP双信号系统对骨骺干细胞生长的立体调节及其机制。 方法：通过免疫组化的方法检测Notch、PTHrP和AP-1共表达；转染PTHrP后MTT检测PTHrP协同Notch促进骨骺干细胞增殖，Westernblot方法检测PTHrP协同Notch抑制其分化及PTHrP和AP-1的表达。 结果：当Notch信号系统被激活时，明显促进PTHrP和AP-1蛋白的表达；转染PTHrP基因后，促进骨骺干细胞增殖作用明显加强(p＜0.05)，collagenⅩ表达也明显减少，明显抑制骨骺干细胞分化；Notch被激活时，明显促进AP-1和PTHrP表达，Notch被抑制时，无AP-1和PTHrP表达。 结论：Notch通过介导AP-1来促进PTHrP的表达，Notch起横向调节作用，PTHrP起纵向调节作用，在骨骺干细胞生长分化过程中成立体调节。

目录

前言

第一部分Notch信号系统对骨骺干细胞生长的调控作用

第二部分Notch和PTHrP双信号系统对骨骺干细胞生长的调控作用

第三部分、结论

综述一Notch信号通路研究进展

综述二PTHrP信号途径在软骨内成骨过程中的调控作用

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