p,p'-DDE、β-BHC及其联合对大鼠睾丸支持细胞Vimentin、N-cadherin和FSHR表达的影响

摘要

p，p’-DDE和β-BHC分别是有机氯农药滴滴涕（DDT，2,2-bis(4-chlorophenyl)-1,1,1-trichloroethane）和六六六(BHC，benzene-hexachloride)的主要代谢产物，因其难以降解、残留期长等特点而在环境中大量残留。研究表明p，p’-DDE 可竞争性结合雄激素受体表现为抗雄激素作用，β-BHC 则具有拟雌激素作用，二者均属于环境内分泌干扰物，可干扰机体正常内分泌，尤其是对生殖系统的影响越来越受到人们的关注。
　　 支持细胞是睾丸生精上皮中的唯一体细胞，为精子的发生提供营养支持，分泌生精细胞必需的生物活性因子，具有血睾屏障的作用，主动参与精子发生过程，帮助生精细胞易位，排出精子等。支持细胞的功能蛋白在生精过程中发挥重要作用。支持细胞的重要骨架蛋白波形蛋白（Vimentin）对维持生精上皮的结构完整性具有重要意义，亦与细胞间的信号传导和细胞凋亡有关。Vimentin的改变直接影响到支持细胞形态和功能。N-钙粘蛋白（N-cadherin）是一种钙依赖性粘附因子，在睾丸支持细胞和生殖细胞相互作用中具有重要作用，对胚胎发育过程中组织分化和形成也有重要作用，且对细胞凋亡具有一定的抑制作用。N-cadherin表达的改变可影响细胞的信号转导，干扰正常的精子发生。生精过程离不开卵泡刺激素（FSH）和睾酮（T）的调节，而FSH是通过与支持细胞上卵泡刺激素受体（FSHR）来发挥作用的，故支持细胞FSHR的表达情况对研究支持细胞功能具有重要意义。本文以p，p’-DDE和β-BHC 作为受试物，进行两者单独及联合染毒，探讨p，p’-DDE、β-BHC 单独及联合作用对大鼠睾丸支持细胞Vimentin、N-cadherin和FSHR的影响，为揭示有机氯农药对雄性生殖系统作用的可能分子机制提供理论依据。
　　 第一部分 p，p’-DDE、β-BHC 及其联合对支持细胞活力的影响
　　 目的：探讨p，p’-DDE、β-BHC 单独及联合染毒对支持细胞活力的影响，确定培养细胞的染毒剂量。
　　 方法：对离体培养两天的支持细胞分别用10、30、50、70μmol/L的p，p’-DDE、β-BHC单独及联合染毒24h，MTT比色法测定其在波长490nm处的吸光度值，计算细胞存活率。
　　 结果：p，p’-DDE、β-BHC 单独及其联合染毒作用于支持细胞24 h后，随着染毒浓度的增加支持细胞的吸光度值逐渐降低。与溶剂对照组相比，p，p’-DDE和β-BHC在50μmol/L和70μmol/L 单独染毒组吸光度明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。50μmol/L 联合组吸光度显著降低，与溶剂对照组和等浓度p,p’-DDE和β-BHC 单独染毒组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。
　　 结论：p，p’-DDE和β-BHC 染毒浓度达50μmol/L 时，开始影响支持细胞的活力；p，p’-DDE和β-BHC 二者联合染毒对支持细胞活性的影响强于单独染毒。
　　 第二部分 p，p’-DDE、β-BHC 及其联合对离体培养支持细胞Vimentin、N-cadherin和FSHR表达的影响目的：探讨p，p’-DDE、β-BHC 及其联合作用对支持细胞Vimntin、N-cadherin和FSHR mRNA和蛋白表达的影响。
　　 方法：分别采用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）和Western blotting 方法测定离体培养支持细胞Vimentin、N-cadherin和FSHR mRNA和蛋白表达情况。
　　 结果：支持细胞内Vimentin mRNA表达水平在10μmol/Lβ-BHC 剂量组明显升高，与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05），其他剂量组均无明显差异。随着各组染毒剂量的增加，Vimentin 蛋白表达呈逐渐降低的趋势，其中各β-BHC组、50μmol/L 联合组与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。随着各组染毒剂量的增加，支持细胞内N-cadherin mRNA表达水平呈先升高后降低趋势，其中30μmol/L p，p’-DDE、30μmol/Lβ-BHC 单独组和10μmol/L联合组表达显著升高，与对照组相比差异具有统计学意义（P＜0.05）。而N-cadherin 蛋白表达水平在30、50μmol/L p，p’-DDE组、50μmol/Lβ-BHC组及各联合组均显著降低，与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。随着各组染毒剂量的增大，FSHR mRNA表达水平呈先升高后降低趋势，其中10μmol/L p，p’-DDE和10μmol/Lβ-BHC 单独组表达明显升高，与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。50μmol/L 各组表达均降低，其中β-BHC 及联合组与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。10、50μmol/L p，p’-DDE组、各剂量β-BHC组及50μmol/L 二者联合组FSHR的蛋白表达水平均降低，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）；10μmol/L 联合组与等浓度 p，p’-DDE和β-BHC 单独组相比，单独组FSHR mRNA表达水平降低明显，差异具有统计学意义（P<0.05）；30μmol/L 联合组与等浓度β-BHC组比，β-BHC组FSHR mRNA表达水平降低明显，与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。
　　 结论：p，p’-DDE、β-BHC 单独及联合作用于离体培养的支持细胞24 h后，较低剂量β-BHC 可刺激Vimentin mRNA表达升高，高剂量的p，p’-DDE、β-BHC单独及二者联合作用均可下调支持细胞Vimentin 蛋白的表达。较低剂量的p，p’-DDE、β-BHC 及其联合作用可刺激N-cadherin mRNA表达升高；p，p’-DDE、β-BHC 单独及二者联合作用可抑制N-cadherin 蛋白的表达。较低剂量的p，p’-DDE、β-BHC 单独及二者联合作用可刺激支持细胞FSHRmRNA表达升高，而高剂量可抑制FSHR mRNA表达；p，p’-DDE和β-BHC 可下调支持细胞FSHR 蛋白的表达，二者联合作用比单独组弱。
　　
　　 第三部分 p，p’-DDE、β-BHC 及其联合对青春期SD 大鼠睾丸Vimentin、N-cadherin和FSHR表达的影响目的：探讨p，p’-DDE、β-BHC 及其联合作用对青春期SD 大鼠睾丸内Vimentin、N-cadherin和FSHR mRNA和蛋白表达的影响。
　　 方法：分别采用实时荧光定量PCR、免疫组化和Western blotting 方法测定青春期SD 大鼠睾丸组织Vimentin、N-cadherin和FSHR mRNA和蛋白的表达情况。
　　 结果：在p，p’-DDE 染毒组，随着染毒剂量的增大，Vimentin mRNA表达水平呈先升高后下降趋势，60mg/kg 剂量组明显升高，与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。随着染毒剂量的升高，Vimentin 从曲精小管基底膜移向管腔，分布紊乱，蛋白表达逐渐降低，60、100mg/kg 剂量组下降明显，与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。Β-BHC和联合组mRNA和蛋白表达均明显降低，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。各染毒组N-cadherin mRNA表达水平与对照相比均没有明显差异。而N-cadherin 蛋白表达水平随着p，p’-DDE 染毒剂量的增大逐渐降低，100mg/kg p,p’-DDE、β-BHC和联合组表达均显著降低，与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05），但联合组与等浓度单独组相比没有明显差异。FSHR mRNA表达随着p，p’-DDE 染毒剂量的增大先升高后降低，60mg/kg组表达升高明显，β-BHC 染毒组表达明显降低，联合组则变化不大，与对照组相比，FSHR 蛋白表达在100mg/kg p，p’-DDE、β-BHC和联合组均显著降低，与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05），但联合组与等浓度单独组没有明显差异。
　　 结论：在基因水平，较低剂量的p，p’-DDE 可促进青春期SD 大鼠睾丸Vimentin mRNA的表达，100mg/kg的β-BHC和联合组可下调Vimentin mRNA表达。在蛋白质水平，p，p’-DDE、β-BHC 可下调青春期大鼠睾丸组织Vimentin的表达。
　　 P，p’-DDE和β-BHC 对青春期SD 大鼠睾丸组织N-cadherin mRNA 没有明显影响，但可下调其蛋白的表达。在基因水平，较低剂量的p，p’-DDE 可刺激青春期SD 大鼠睾丸FSHR mRNA的表达，100mg/kg的β-BHC 可抑制FSHR mRNA表达。在蛋白质水平，100mg/kg的p，p’-DDE、β-BHC 及其联合均可下调FSHR 蛋白表达，联合组与单独组没有明显差别。
　　 本研究显示，体内体外实验结果基本一致，结合本实验室前期研究，我们得到如下结论：p，p’-DDE和β-BHC 可通过干扰大鼠睾丸支持细胞Vimentin、N-cadherin和FSHR的表达，影响雄性生殖系统功能。

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前 言

第一部分 p, p’-DDE、β-BHC 及其联合对支持细胞活力的影响

第二部分 p, p’-DDE、β-BHC 及其联合对离体培养支持细胞Vimentin、N-cadherin 和FSHR 表达的影响

第三部分 p, p’-DDE、β-BHC 及其联合对青春期大鼠睾丸组织Vimentin、N-cadherin 和FSHR 表达的影响

小 结

参考文献

综述

致 谢