格列齐特对高血糖导致内皮祖细胞损伤的影响及机制研究

摘要

第一部分:
　　 目的：内皮功能障碍被认为是2 型糖尿病血管病变重要的发病机制之一，氧化应激在其发病中发挥着重要作用。格列齐特作为第二代磺脲类口服降糖药，因其特有的氮杂环结构，已被许多研究证实具有抗氧化能力，但是，它对内皮功能的作用及其机制仍不十分清楚。因此，本课题着重研究格列齐特对新诊断2 型糖尿病患者内皮功能的影响，并对其机制进行初步探讨。
　　 方法：选取2007年8月至2008年12月期间于我院内分泌科门诊就诊的33 名新诊断2 型糖尿病患者（病例组）以及性别和年龄匹配的25名健康体检者（对照组）作为研究对象。所有新诊断2 型糖尿病患者均给予格列齐特缓释片口服治疗（30-90mg/天），持续约12周。统计病例组治疗前后以及对照组的临床资料和生化检测。采用高分辨率超声检测技术观察肱动脉血流介导的血管内皮依赖的舒张功能（FMD）和硝酸甘油介导的非内皮依赖的舒张功能（NMD）；应用流式细胞仪方法检测循环EPC（CD45low /CD34+/VEGFR2+）的数目；硫代巴比妥酸法、黄嘌呤氧化法以及硝酸还原酶法分别测定血清丙二醛（MDA）、总超氧化物歧化酶（SOD）活性和NO的水平。
　　 结果：格列齐特治疗12周可有效降低糖尿病患者血糖水平（P＜0.05），改善胰岛素抵抗（P＜0.05）。治疗前糖尿病患者的FMD、循环EPC的数目以及血清总SOD的活性均低于对照组水平（P＜0.05），而经过格列齐特治疗后这些指标得到明显改善。相关分析发现，FMD和FMD/NMD的改变与循环EPC的改变存在明显的相关性（0.496、0.477，P＜0.05）。而病例组血清MDA和NO的基线水平，较对照组明显升高（P＜0.05），格列齐特治疗后均出现明显下降（P＜0.05）。
　　 结论：新诊断2 型糖尿病患者的FMD和循环EPC的数目明显降低，机体氧化应激损伤严重，经过格列齐特治疗后，糖尿病患者的FMD和循环EPC的数目增加明显，与此同时，机体氧化应激状态得到明显改善，提示格列齐特可恢复糖尿病患者的内皮功能，可能与其改善氧化应激状态有关。
　　 第二部分:
　　 目的：作为内皮祖细胞（EPC）的主要储存库，骨髓容量大小反映机体EPC的储备状况，前一部分的研究已经证实格列齐特能有效增加糖尿病患者外周血的EPC的水平，但是其对EPC的储存库是否也有作用，目前尚未清楚。同时EPC的功能与数目在维系内皮再生和新生血管形成中同等重要，而氧化应激被认为是糖尿病时EPC 功能受损的主要机制，格列齐特已被证实具有抗氧化作用，因此，本实验研究格列齐特对糖尿病大鼠骨髓EPC的数目和功能的影响，并对其机制进行初步探讨。
　　 方法：将40只Wistar 大鼠随机分为两组，正常组（CT）和糖尿病组（DM），后者以60mg/kg的剂量腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病模型，以血糖＞16.7mmol/L的认定为造模成功。将这两组各自再分为两个亚组（CT组和CT+Gli组，DM组和DM+Gli组），分别给予生理盐水或是格列齐特灌胃（20mg/kg/day）。6周后将实验动物处死，取股骨和胫骨骨髓分离单个核细胞，进行EPC的体外培养（M199 培养基，20％Gibco胎牛血清，20ng/ml 血管内皮生长因子，0.1ng/ml 碱性成纤维生长因子），培养至第7天时进行Dil-ac-LDL （ac-LDL）和FITC-UEA-1 （UEA-1）双染鉴定，并分别采用MTT分析和Transwell 小室进行增殖功能和迁移功能的检测，第11天进行集落计数。以硫代巴比妥法测定血清中MDA 水平。
　　 结果：ac-LDL和UEA-1 双染鉴定的EPC 认为是正在分化的EPC，进行镜下计数发现，DM组的双染细胞明显少于CT组（P＜0.01），格列齐特治疗后双染细胞明显增多（P＜0.05），而格列齐特对正常大鼠则没有明显作用（P ＞0.05）；此外，相比CT组，DM组大鼠的骨髓EPC的增殖和迁移功能和集落功能也明显受损，但格列齐特能改善其受损的功能，而C T＋Gli组则没有此效应。测定血清MDA 发现，DM 大鼠血清MDA水平明显升高，而DM+Gli组较DM组明显降低，Pearson分析得出，MDA的水平与双染细胞的数目以及EPC的增殖、迁移和集落形成等功能呈负相关（-0.71，-0.63，-0.54，-0.58，P＜0.01）。
　　 结论：格列齐特能增加糖尿病大鼠骨髓储存的EPC，并且对EPC的增殖、迁移和集落形成等功能也有改善作用，提示格列齐特能从增加骨髓EPC的数目和改善其功能等两方面来增强EPC 修复内皮的作用，并且发现这种作用与其抗氧化能力密切相关，而不依赖于其降低血糖的效应，从而进一步证实了其对血管的保护作用。
　　 第三部分:
　　 目的：内皮祖细胞（EPC）参与受损内皮的修复和新生血管的形成，糖尿病时机体损伤血管的自我修复能力减弱，许多研究表明糖尿病导致EPC 数目减少，并认为高糖导致EPC 凋亡增多是其中的机制之一，既往研究发现格列齐特对内皮细胞和β细胞均具有抗凋亡作用，因此，我们推测其对EPC的凋亡可能也具有保护作用。
　　 方法：正常大鼠骨髓分离的EPC在体外不同条件下培养，包括5.5mM 葡萄糖（NG），25mM 葡萄糖（HG），格列齐特预处理后25mM 葡萄糖（HG+Gli）以及甘露醇渗透压对照（MAN）。采用Annexin V和PI 标记流式细胞仪检测EPC的凋亡情况。DCFH-DA的方法测定细胞内活性氧（ROS）的产生，同时检测细胞重要的抗氧化酶MnSOD和过氧化氢酶的活性及mRNA表达的水平，以及产生ROS的来源NADPH 氧化酶的活性。并应用PI3K 抑制剂wortmannin后检测t-Akt，p-Akt，t-FOXO3a和p-FOXO3a的蛋白水平，以及相关凋亡基因Bim和FasL的mRNA的表达水平。
　　 结果：高糖条件下培养的EPC的凋亡和ROS的产生明显多于正糖组（P＜0.05），而格列齐特对高糖诱导EPC的凋亡和ROS 产生均具有抑制作用（P＜0.05），并且发现其恢复高糖损伤的MnSOD和过氧化氢酶的活性和mRNA的表达，以及减少NADPH氧化酶的活性从而改善EPC的氧化应激。此外还发现高糖引起p-Akt/t-Akt，p-FOXO3a/t-FOXO3a的比值下降，格列齐特则通过激活PI3K 使其增加，并减少了FOXO3a下游凋亡相关基因Bim和FasL的mRNA表达。
　　 结论：格列齐特从增加ROS的清除和减少ROS的生成两方面来改善高糖诱导的氧化应激，进而抑制ROS 引起的EPC 凋亡。并发现格列齐特通过阻止FOXO3a 及其下游凋亡基因的激活而抑制EPC 凋亡，这一作用具有部分PI3K/Akt 依赖性。

目录

声明

第一部分 格列齐特对新诊断2型糖尿病患者内皮功能的影响

第二部分 格列齐特对糖尿病大鼠骨髓来源的内皮祖细胞的数目及功能的影响

第三部分 格列齐特通过PI3K/AKT 通路调节高糖诱导的EPC 的凋亡

本课题创新重点

综述 内皮祖细胞与糖尿病及其并发症

全文总结和展望

附录 攻读博士期间发表的论文

致谢