轮状病毒NSP4及其表位肽在胆管闭锁鼠模型损伤中的作用及机理研究

摘要

本课题拟对 NSP4及其 CTL表位激活 CD8+淋巴细胞、继而形成对胆管上皮细胞的特异性杀伤作用进行研究,从而弄清 NSP4导致胆管上皮细胞损伤的机理,为免疫干预降低胆道闭锁的发生率及改善胆道闭锁的预后提供一定的理论依据。
　　如果能找到 NSP4的CTL表位并有针对性地研制疫苗或抗体,将有望达到预防或控制轮状病毒感染的目的而克服轮状病毒或 NSP4疫苗的致病性,从而为通过免疫干预降低胆道闭锁的发生或改善胆道闭锁的预后奠定基础。
　　第一部分
　　整联蛋白α2β1在轮状病毒致肝外胆管上皮细胞损伤中的作用
　　目的:检测肝外胆管上皮细胞整联蛋白的表达类型并进一步探讨其在轮状病毒致肝外胆管上皮细胞损伤中的作用。
　　方法:取 Balb/c小鼠的肝外胆管进行肝外胆管上皮细胞培养至第三天,用直接免疫荧光法检测整联蛋白α2、β1亚基,用间接免疫荧光法检测α4亚基。用透射电镜观察轮状病毒与肝外胆管上皮细胞的结合。然后加入相应的整联蛋白抗体,再加入轮状病毒,观察各组引起的细胞病变(Cytopathic effect,CPE),并进行统计学分析。
　　结果:用直接免疫荧光法检测到了整联蛋白α2、β1亚基存在于肝外胆管上皮细胞膜表面,用间接免疫荧光法检测到了α4亚基存在于肝外胆管上皮细胞膜表面。同时透射电镜观察到了轮状病毒与肝外胆管上皮细胞的结合。加入相应抗体阻断整联蛋白α2β1和α4β1后,CPE较对照组明显减轻,而且 CPE在阻断α2β1组较阻断α4β1组减轻更为明显。
　　结论:肝外胆管上皮细胞表面表达整联蛋白α2、β1和α4亚基并且整联蛋白α2亚基的含量可能大于α4亚基的含量,整联蛋白α2β1可以介导轮状病毒感染肝外胆管上皮细胞从而引起细胞损伤。
　　第二部分
　　轮状病毒 NSP4与整联蛋白α2β1在肝外胆管上皮细胞损伤中的作用
　　目的:探讨轮状病毒 NSP4与整联蛋白α2β1在肝外胆管上皮细胞损伤中的作用。
　　方法:取 Balb/c小鼠的肝外胆管进行肝外胆管上皮细胞培养至第3天,用激光共聚焦方法检测整联蛋白α2、β1亚基及轮状病毒 NSP4。用siRNA干扰技术沉默培养至第3天的肝外胆管上皮细胞的整联蛋白α2后加入轮状病毒,用Real Time RT-PCR方法检测α2亚基及轮状病毒 NSP4的messenger RNA(mRNA)含量,并进行统计学分析。
　　结果:用激光共聚焦方法检测到了整联蛋白α2、β1亚基存在于肝外胆管上皮细胞表面;轮状病毒 NSP4和整联蛋白α2亚基从感染细胞向紧邻的非感染细胞进行扩散;siRNA干扰技术表明沉默整联蛋白α2后轮状病毒 NSP4 messenger RNA(mRNA)含量较对照组减低(P<0.05)。
　　结论:肝外胆管上皮细胞表面表达整联蛋白α2、β1且整联蛋白α2β1是轮状病毒NSP4的受体并进一步导致肝外胆管上皮细胞损伤。
　　第三部分
　　轮状病毒NSP4介导的免疫反应在胆道闭锁鼠模型损伤中的作用
　　目的:探讨表达纯化的轮状病毒NSP4介导的免疫反应在胆道闭锁鼠模型损伤中的作用。
　　方法:对出生后24小时内的新生鼠腹腔注射表达纯化的轮状病毒NSP4,分别于腹腔注射后7、14天用胞内细胞因子染色法检测肝脏CD8+淋巴细胞释放的IFN-γ,用乳酸脱氢酶释放法检测CD8+淋巴细胞对培养的肝外胆管上皮细胞(感染RRV与未感染RRV组)的杀伤程度,酶联免疫斑点法检测肝脏淋巴细胞释放的IFN-γ,用ELISA法检测小鼠外周血清IFN-γ的含量,并研究剔除CD8+淋巴细胞后肝脏淋巴细胞及外周血清释放IFN-γ的情况及肝外胆管的损伤程度。
　　结果:胞内细胞因子染色结果表明NSP4免疫后肝脏C D8+淋巴细胞释放的I F N-γ含量大于对照组( P<0.05);细胞杀伤实验结果表明 NSP4免疫后肝脏C D8+淋巴细胞对肝外胆管上皮细的杀伤效应明显强于对照组( P<0.05),且对感染了RRV的肝外胆管上皮细胞的杀伤效应强于未感染 RRV组;酶联免疫斑点结果表明肝脏淋巴细胞释放的I F N-γ含量大于对照组( P<0.05);外周血清 ELI S A检测结果表明 I FN-γ释放量大于对照组( P<0.05);剔除 C D8+ T淋巴细胞后肝脏淋巴细胞及外周血清释放的IF N-γ含量明显降低( P<0.05)并且肝外胆管的损伤程度较阻断前明显减轻。
　　结论:轮状病毒NSP4介导的CD8+淋巴细胞引起的免疫反应在肝外胆管的损伤中具有重要作用。
　　第四部分
　　轮状病毒NSP4表位肽的预测与研究
　　目的:研究并明确轮状病毒NSP4的CTL表位肽。
　　方法:运用生物信息学方法预测并固相多肽合成轮状病毒NSP4的CTL表位肽,对出生后24小时内的新生鼠腹腔注射合成的NSP4表位肽及激动剂,分别于腹腔注射后7、14天用胞内细胞因子染色法检测肝脏CD8+淋巴细胞释放的IFN-γ,用乳酸脱氢酶释放法检测CD8+淋巴细胞对培养的肝外胆管上皮细胞(感染RRV与未感染RRV组)的杀伤程度,酶联免疫斑点法检测肝脏淋巴细胞释放的IFN-γ,用ELISA法检测小鼠外周血清IFN-γ的含量。
　　结果:胞内细胞因子染色结果表明NSP4157-170和NSP4144-152较NSP424-32和NSP493-110组肝脏CD8+释放的IFN-γ明显增多( P<0.05);细胞杀伤实验结果表明NSP4157-170和NSP4144-152较NSP424-32和NSP493-110组肝脏CD8+对肝外胆管上皮细胞的杀伤效应明显强于 NSP424-32和NSP493-110组( P<0.05),且对感染了RRV的肝外胆管上皮细胞的杀伤效应强于未感染 RRV组;酶联免疫斑点结果表明NSP4157-170和NSP4144-152较NSP424-32和NSP493-110组肝脏淋巴细胞释放的I FN-γ明显增多( P<0.05);外周血清 ELI S A检测结果表明 NSP4157-170和NSP4144-152较NSP424-32和NSP493-110组释放的I FN-γ明显增多( P<0.05)。
　　结论:NSP4157-170和NSP4144-152可能是轮状病毒NSP4的CTL表位肽。

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正文

第一部分整联蛋白α2β1在轮状病毒致肝外胆管上皮细胞损伤中的作用

引言

材料

方法

结果

讨论

参考文献

第二部分轮状病毒NSP4与整联蛋白α2β1在肝外胆管上皮细胞损伤中的作用

引言

材料

方法

结果

讨论

参考文献

第三部分轮状病毒NSP4介导的免疫反应在胆道闭锁鼠模型损伤中的作用

引言

材料

方法

结果

讨论

参考文献

第四部分轮状病毒NSP4表位肽的预测与研究

引言

材料

方法

结果

讨论

参考文献

结论

综述

一、巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）

二、Ⅲ型呼肠孤病毒（Reovirus type 3）

三、轮状病毒

参考文献

攻读学位期间发表论文

致谢