猕猴轮状病毒(RRV)致胆道闭锁(BA)Balb/c小鼠模型的建立及LDOC1基因在模型中的表达

摘要

目的:应用RRV感染Balb/c新生小鼠建立胆道闭锁动物模型,并在模型中检测LDOC1表达及NF-κB介导的炎症和凋亡反应。方法:感染组(n=31)新生小鼠出生后24小时内腹腔注射RRV(20μl 106 PFU)；对照组(n=30)新生小鼠出相同时间腹腔注射20μl细胞培养液(EME)。生后5日内死亡或拒乳小鼠被排除出研究。对比观察2组小鼠体重增长变化、无毛区黄染情况至第15天取材；取材后检测2组小鼠总胆红素(TBI)、直接胆红素(DBI)、谷丙转氨酶(AST)和谷草转氨酶(ALT)数值差异；HE染色分析小鼠肝内外病理变化；免疫组化(IHC)检测2组小鼠肝脏内LDOC1和NF-κB的表达差异；酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠血清NF-κB下游炎症因子(IL-2、TNF-α)蛋白含量变化；利用末端脱氧核苷酸原位标记法(TUNEL法)检测肝脏组织中细胞凋亡率改变。对RRV感染小鼠组内出现完全肝外闭锁小鼠和未出现完全肝外闭锁小鼠上述指标同样进行对比。结果:(1)对照组RRV感染组小鼠第5天平均体重较对照组降低，但两者无统计学差异(p=0.075>0.05)。从第7天至15天取材时，两组小鼠体重出现显著性差异，其中第11天差异最大。(2) RRV感染组小鼠从第5天开始出现无毛区皮肤黄染，且TBI,DBI和AST, ALT水平与对照组相比显著升高;HE检查发现RRV感染组中68.8%小鼠出现完全性的肝外胆道闭锁，所有小鼠肝脏内均出现不同程度的炎症反应和肝内小胆管增生。(3)免疫组化分析发现，RRV感染组小鼠肝脏内LDOC1和NF-κB抗体阳性表达率(64.0%, 76.0%)，与对照组(26.9%, 34.6%)相比显著升高。ELISA法检测RRV感染组小鼠血清IL-2和TNF-α蛋白光密度均值较对照组明显升高; RRV感染组小鼠肝脏组织凋亡细胞比率与对照组相比显著降低;相关研究分析发现感染组内LDOC1和NF-κB抗体阳性表达存在相关性(p=0.004<0.01);(4)RRV感染组小鼠中，出现肝外胆道闭锁的小鼠平均体重增长较未闭锁小鼠缓慢，第13天和15天平均体重存在显著性差异;闭锁小鼠TBI, DBI较未闭锁小鼠显著升高;但AST, ALT无明显统计学差异。(5)肝外胆道闭锁小鼠肝组织LDOC1和NF-κB抗体阳性表达率与未闭锁小豁目比显著升高。血清ELISA检测结果发现肝外胆道闭锁小鼠IL-2和TNF-α蛋白光密度均值高于未闭锁小鼠;两者细胞凋亡率无统计性差异(40.3±5.9% vs 37.8±4.8%,p=0.068>0.05)。结论:(1) RRV感染新生小鼠可成功制备出与人类胆道闭锁临床和病理相似的动物模型。(2)NF-κB介导的炎症、凋亡反应在RRV感染致胆道闭锁动物模型中起重要作用。(3)LDOC1在该动物模型中的高表达，并与NF-κB表达的相关性提示 LDOC1可能通过调控NF-κB介导的炎症和凋亡反应对胆道闭锁的发生产生影响，提示其参与胆道闭锁形成的可能性。