应用液质联用技术测定大鼠血浆中Thailandepsin B及其药代动力学研究

摘要

背景：Thailandepsin B（TDP-B）TDP-B是一种具有抗肿瘤作用的组蛋白脱乙酰化酶抑制剂。肿瘤细胞中组蛋白脱乙酰化酶异常表达，从而导致组蛋白大部分呈低乙酰化状态。组蛋白去乙酰化酶抑制剂通过调整肿瘤细胞中组蛋白异常的乙酰化状态，使组蛋白乙酰化水平增高，诱导特定基因表达增加，从而导致肿瘤细胞凋亡，达到抗肿瘤作用效果。
　　目的：阐明TDP-B在大鼠体内的药代动力学特征，为TDP-B的成药性评价及其进一步的开发提供科学依据。
　　方法：首先，开发和验证基于液质联用技术（LC-MS/MS）的测定大鼠血浆中TDP-B含量的生物分析方法。然后，对三组大鼠分别经尾静脉给予3.00mg/kg、9.00mg/kg、27.0mg/kg剂量的TDP-B并采集给药后不同时间点的血样。通过测定大鼠血浆样品中的TDP-B浓度，获得TDP-B的药代动力学参数，并考察药代动力学的暴露值（曲线下面积）与剂量之间的线性关系。样品的LC-MS/MS分析方法优化主要体现在样品预处理和制备方法、色谱分离条件和质谱检测参数等方面的优化。通过在全血和血浆样品加入酸和酯酶抑制剂的样品预处理方法解决了TDP-B在生物基质中不稳定问题。样品制备主要是通过采用乙酸乙酯溶剂对血浆样品进行液液萃取的方式完成。色谱分析采用梯度洗脱程序完成，其流动相A由0.1％甲酸+5mM甲酸铵组成,流动相B由甲醇/乙腈(8/2,V/V)组成，流速为0.800mL/min；色谱柱为Phenomenex Gemini C18柱（50 mm×2.0mm,5μm）。质谱检测采用电喷雾离子源（ESI）并在正离子模式下采用多反应监测（MRM）模式对分析物进行定量分析。定量分析时，分析物TDP-B和内标非索非那定所选用的MRM离子对分别为m/z530.3→277.2和m/z502.5→466.2。根据美国食品药品监督管理局（FDA）对生物样品分析方法验证法规的要求，本研究对方法的特异性、灵敏度、线性范围、精密度与准确度、基质效应、回收率及稳定性等参数进行了相关考察。在完成生物分析方法完整验证后，对所有药代动力学研究中的大鼠血浆样品中的TDP-B进行定量分析，并应用Winnolin软件计算获得 TDP-B的药代动力学参数。此外，本研究还对血浆样品中检测到的一个代谢产物（M）的结构进行了初步鉴定。
　　结果及结论：其一、在样品预处理过程中，通过在全血和血浆中加入0.25％甲酸、0.625％盐酸和2.5mM Dichlorvos混合稳定剂，TDP-B在大鼠血浆及全血当中的稳定性问题得到解决。其二、本研究成功建立了基于LC-MS/MS测定大鼠血浆中TDP-B浓度的分析方法。本方法的线性范围为1.00-1000ng/mL，具有较高的灵敏度（LLOQ为1.00ng/mL）和较短的分析时间（3.7min/每个样品），具有较好的批内、批间精密度（RSD≤10.9％）和较好的准确度（RE％为-6.7％-15％）。其三、大鼠药代动力学研究结果表明，TDP-B在3.00mg/kg-27.0mg/kg的剂量范围内的药时曲线下面积与剂量呈正比，符合线性动力学特征。其四、初步推测大鼠真实样品中的一个代谢产物（M）为TDP-B在体内还原成TDP-B*后再发生氧化反应生成的一相代谢产物。
　　意义：首先，本研究开发的增加TDP-B在大鼠全血和血浆样品中稳定性的样品预处理方法为确保TDP-B的准确测定及后续的药代动力学研究奠定了基础，也为其他在生物基质样品中不稳定药物的样品预处理方法提供了借鉴。其次，本研究首次建立了快速、灵敏、可靠的测定大鼠血浆中TDP-B的生物分析方法，进而获得TDP-B在大鼠体内的药代动力学参数，为TDP-B的成药性评价提供了科学依据。再次，本研究对TDP-B在大鼠体内代谢产物进行了初步探索，并发现了一个代谢产物（M），为进一步研究TDP-B在大鼠体内的活性代谢产物奠定了基础，也为解释TDP-B抗肿瘤作用机制提供了科学依据。

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前言

第一部分．LC-MS/MS 测定大鼠血浆中 TDP-B 含量分析方法的建立

1.实验材料与方法

1.1仪器，试剂及药品

1.2测定方法

2.测定方法的优化过程

2.1还原产物制备，检测及TDP-B同位素峰的确证

2.2色谱条件与质谱参数优化

2.3内标的选择

2.4样品预处理条件的优化

2.5基质稳定性条件的优化

3.小结

第二部分.LC-MS/MS 定量大鼠血浆中 TDP-B 的分析方法的确证

1.实验材料与方法

1.1仪器，药品和试剂

1.2储备液和工作溶液的制备

1.3样品制备与测定方法

1.4专属性试验

1.5标准曲线的建立

1.6定量下限、批内和批间精密度与准确度试验

1.7残留效应

1.8回收率试验

1.9基质效应试验

1.10稳定性试验

1.11样品收集稳定性实验

1.12稀释可靠性试验

1.13溶血性评估试验

2.实验结果

2.1 LC-MS/MS测定大鼠血浆中TDP-B含量分析方法的确证

3.方法学确证小结

第三部分.TDP-B在大鼠体内的药代动力学研究

1.实验材料与方案

1.1实验动物

1.2实验设计与分组

1.3给药后样本的采集、处理与测定

1.4血药浓度-时间曲线与药动学参数计算

2.实验结果

3.小结

第四部分.代谢产物的鉴定

1.实验材料与方法

1.1仪器，药品和试剂

1.2样品制备与测定方法

2.代谢产物鉴定过程及结果讨论

3.小结

全文总结

参考文献

综述

参考文献

致谢