硫辛酸在氯化镉致HepG2细胞损伤中的抗氧化作用研究

摘要

镉广泛存在于生产和生活环境中，是一种常见的环境重金属污染物，同时也是一种多器官的累积毒物，其中肝脏是主要的靶器官。在人体内的半衰期可长达6.2～18年，为最易在人体内蓄积的毒性物质。有研究证实，氯化镉可攻击机体抗氧化防御系统，产生氧化应激，造成体内ROS的累积，进而引起脂质过氧化反应、DNA链断裂等。此外，镉可以诱导许多早期应激反应基因异常表达,而基因异常表达与肿瘤的发生密切相关。镉引起细胞凋亡也与镉的毒性作用有关。
　　硫辛酸（lipoic acid简称：LA），又名二硫辛酸，系统命名为1，2-二硫戊环-3-戊酸，分子式为C8H14O2S2，其相对分子质量为206.33，是一种天然的二硫化物，它的负氧化还原电位为-290mV，在天然抗氧化剂中是最低的，故硫辛酸是天然抗氧化剂中效率较高的抗氧化剂。此外，因其兼具有水溶性和脂溶性，有时又被称为“万能抗氧化剂”。硫辛酸除具有一般抗氧化剂具有的特性外，如清除自由基、螯合金属离子、修复DNA损伤等抗氧化功能；另外，LA还具有实时在线再生其他抗氧化剂（如GSH、VC、VE）的功能。
　　本研究主要以氯化镉染毒HepG2细胞产生氧化损伤模型，检测硫辛酸对氯化镉致HepG2细胞的细胞活力、ROS水平、MDA含量、DNA损伤以及GSH含量的影响，以期阐明硫辛酸的抗氧化作用。
　　一、硫辛酸对氯化镉致HepG2细胞活力降低的影响
　　目的：探讨不同浓度的硫辛酸对氯化镉致HepG2细胞活力水平的影响。
　　方法：采用MTT试验来检测细胞活力。HepG2细胞先用不同浓度的硫辛酸（0.1mg/L、1mg/L、10mg/L）预处理8h，并在硫辛酸实时保护的条件下，25μmol/L氯化镉处理16h后检测其对细胞活力的影响。
　　结果：25μmol/L氯化镉染毒HepG2细胞16h后，细胞活力下降至82.5％；10mg/L的硫辛酸组，细胞活力未发生显著性变化（与正常对照相比，P>0.05）；与25μmol/L氯化镉组相比较，预先在培养液中加入不同浓度硫辛酸（0.1mg/L、1mg/L、10mg/L）后，HepG2细胞活力随着硫辛酸浓度的增加而增强，且差异有统计学意义（P<0.05，P<0.05，P<0.05）。此外，氯化镉-硫辛酸联合作用组间，两两比较细胞活力有统计学差异（P<0.05，P<0.05，P<0.05）。
　　结论：25μmol/L氯化镉可降低HepG2细胞活力，而硫辛酸可拮抗此浓度氯化镉所致的HepG2细胞活力的降低。
　　二、硫辛酸对氯化镉致HepG2细胞内ROS水平的影响
　　目的：研究不同浓度硫辛酸对氯化镉诱导HepG2细胞内产生ROS水平的影响。
　　方法：HepG2细胞先用不同浓度的硫辛酸（0.1mg/L、1mg/L、10mg/L）预处理8h，并在硫辛酸实时保护的条件下，氯化镉染毒HepG2细胞产生ROS，以DCFH-DA作为荧光探针，采用多功能酶标仪检测氯化镉、硫辛酸单独与联合作用下HepG2细胞内ROS水平。
　　结果：25μmol/L氯化镉作用HepG2细胞2h后，DCF荧光强度较正常对照升高（P<0.05）；10mg/L的硫辛酸组，细胞内荧光强度较正常对照组略有降低，但并无显著性差异（P>0.05）；不同浓度硫辛酸预处理后，荧光强度值降低，且随着硫辛酸浓度增加，DCF荧光强度值呈降低趋势；并且中剂量（1mg/L）和高剂量（10mg/L）硫辛酸-氯化镉联合作用组与低剂量（0.1mg/L）硫辛酸-氯化镉联合作用组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。
　　结论：硫辛酸能有效的减少胞内ROS累积，对氯化镉所致HepG2细胞内ROS水平的增高具有拮抗作用。
　　三、硫辛酸对氯化镉致HepG2细胞内MDA含量的影响
　　目的：探讨不同浓度硫辛酸对氯化镉染毒HepG2细胞内MDA含量的影响。
　　方法：采用TBA法检测不同处理因素下HepG2细胞内MDA含量的变化。HepG2细胞先用不同浓度的硫辛酸（0.1mg/L、1mg/L、10mg/L）预处理8h，并在含有硫辛酸培养液中加入终浓度为25μmol/L氯化镉，继续培养16h，多功能酶标仪检测其对MDA含量的影响。
　　结果：与正常对照相比，25μmol/L氯化镉组MDA含量明显增加（P<0.05）；10mg/L的硫辛酸组，细胞内MDA含量较正常对照组有所降低，但并无显著性差异（P>0.05）；不同浓度硫辛酸预处理后，随着硫辛酸浓度增加，MDA含量逐渐降低。并且中剂量（1mg/L）和高剂量（10mg/L）硫辛酸-氯化镉联合作用组与低剂量（0.1mg/L）硫辛酸-氯化镉联合作用组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。
　　结论：硫辛酸能降低脂质过氧化物MDA含量，对氯化镉所致HepG2细胞内MDA含量的增高具有拮抗作用。
　　四、硫辛酸对氯化镉致HepG2细胞内DNA氧化损伤的影响
　　目的：研究不同浓度硫辛酸对氯化镉诱导HepG2细胞DNA氧化损伤的影响。
　　方法：HepG2细胞先用不同浓度的硫辛酸（0.1mg/L、1mg/L、10mg/L）预处理8h，并在含有硫辛酸培养液中加入终浓度为25μmol/L氯化镉，继续培养4h。采用单细胞凝胶电泳技术，检测硫辛酸对氯化镉诱导HepG2细胞内DNA氧化损伤的影响。
　　结果：25μmol/L氯化镉组Olive尾矩值较正常组明显增加（P<0.05），说明此浓度氯化镉可造成DNA损伤；不同浓度硫辛酸预处理后，Olive尾矩值降低，其降低幅度与硫辛酸浓度间呈依赖关系；不同浓度硫辛酸-氯化镉联合作用组，两两比较有统计学差异（P<0.05）。
　　结论：硫辛酸对氯化镉所致HepG2细胞DNA氧化损伤具有拮抗作用。
　　五、硫辛酸对氯化镉染毒HepG2细胞内GSH含量的初步研究
　　目的：初步探讨硫辛酸对氯化镉染毒HepG2细胞内GSH含量的影响。
　　方法：HepG2细胞先用不同浓度的硫辛酸（0.1mg/L、1mg/L、10mg/L）预处理8h，并在含有硫辛酸培养液中加入终浓度为25μmol/L氯化镉，继续培养16h。采用DTNB法结合GSH和GSSG检测试剂盒，检测硫辛酸对氯化镉染毒HepG2细胞内GSH含量的影响。
　　结果：与正常对照相比，25μmol/L氯化镉组胞内GSH含量降低（P<0.05）；与氯化镉组相比，不同浓度硫辛酸预处理后，仅10mg/L硫辛酸-氯化镉联合组细胞内GSH含量略微增加，但未发现统计学差异（P>0.05），且未出现明显的剂量依赖关系。
　　结论：10mg/L及以下浓度的硫辛酸对氯化镉诱发HepG2细胞GSH含量无明显影响。

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前言

一、硫辛酸对氯化镉致HepG2细胞活力降低的影响

材料和方法

结果

讨论

二、硫辛酸对氯化镉诱导HepG2细胞产生ROS水平的影响

材料和方法

结果

讨论

三、硫辛酸对氯化镉致HepG2细胞内MDA含量的影响

材料和方法

结果

讨论

四、硫辛酸对氯化镉致HepG2细胞DNA氧化损伤的影响

材料和方法

结果

讨论

五 硫辛酸对氯化镉诱导HepG2细胞产生GSH含量的初步研究

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

综述

附录

致谢