研 究 生 姓 名： 李宁娟
导师姓名 职称： 李江伟 教授
摘 要
Abstract
第一部分 文献综述
1.抗体以及骆驼纳米抗体
2.B细胞抗体库以及高通量测序技术
3.血清抗体库以及质谱技术
4.质谱技术和高通量测序技术在抗体发现和抗体制备中的应用
5.蛋白组学和高通量测序技术在疾病中运用
展望
第二部分 骆驼免疫抗体库高通量测序分析以及纳米抗体数据库的建立
目前还未有利用高通量测序技术分析并建立骆驼的抗CD47纳米抗体库。本研究首先分离骆驼淋巴细胞，提取总
1.实验材料
1.3 主要试剂
1.4 试验引物
5'-GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG-3'
5'-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3'
barcode8-VHH-back
barcode9-PMCF
1.5 主要溶液配制
2.实验方法
2.1 抗原CD47的大量诱导表达以及纯化
2.2 Western Blot检测抗原CD47表达
2.4 间接ELISA检测骆驼血清中抗CD47抗体滴度
2.5 新疆双峰驼全血中外周淋巴细胞的分离
2.6 新疆双峰驼外周淋巴细胞总RNA的提取以及反转录
2.7 巢式PCR扩增VHH基因片段
(1)使用巢式PCR扩增VHH基因片段，首先使用第一轮引物CALL01-Leader 和CALL02-CH
表2-2
PCR反应条件： 95 ℃ 变性5 min
(2)第二轮PCR扩增：以第一轮切胶回收基因产物为模板，使用加入bracode序列VHH-back和PMC
表2-3
PCR反应条件同上。
2.8 VHH序列的NGS测序以及NGS氨基酸数据库的建立
3.实验结果
3.1 抗原CD47的纯化以及Western Blot鉴定
3.2 抗原CD47免疫新疆双峰驼血清效价测定
3.3 骆驼外周淋巴细胞RNA的提取以及VHH片段的获得
图2-3A 图2-3B
Note：DNA marker (DL2000)
图 2-3 骆驼外周淋巴细胞总RNA的提取以及VHH基因片段的扩增
Fig.2-3 Total RNA of PMCF and Amplification of VHH
3.4 NGS原始数据的处理
3.5 VHH抗体库NGS测定以及CDR3序列以及等电点分析
3.6 抗CD47纳米抗体氨基酸数据库的建立
4.讨论
第三部分 骆驼免疫血清中抗CD47特异性抗体的制备和鉴定
1.实验材料
1.1 实验主要试剂
1.2 主要溶液的配制
2.实验方法
2.1 利用ProteinA纯化骆驼血清中IgG的纯化
2.2 CD47免疫和柱制备
2.3 CD47-IgG的免疫亲和纯化
2.4 间接 ELISA筛选抗CD47特异性抗体洗脱液
2.7 细胞ELISA检测免疫血清，免疫IgG和抗CD47-IgG与EC9706结合活性
3.实验结果
3.1 骆驼血清IgG的纯化以及ELISA检测与原核CD47结合活性
3.2 免疫亲和层析柱的偶联
3.3 抗CD47特异性抗体洗脱液的筛选
3.4 抗CD47特异性抗体的纯化
3.5 ELISA和Western Blot检测抗CD47特异性抗体与原核CD47结合活性
3.6 血清、IgG以及抗特异性CD47多克隆抗与真核CD47结合性检测
3.7 血清、IgG以及抗特异性CD47多克隆抗体与EC9706结合性检测
4.讨论
第四部分 骆驼重链抗体的质谱分析以及抗CD47纳米抗体制备和鉴定
1.实验材料
2.实验方法
2.1 样品制备
2.2 胶内酶解
2.3质谱分析
2.3.1 毛细管高效液相色谱
2.3.2 质谱鉴定
2.4 数据分析
2.5 纳米抗体克隆表达，纯化
2.6 ELISA鉴定抗CD47纳米抗体结合活性
2.7 噬菌体展示技术筛选的阳性克隆与高通量测序和质谱数据的相关分析
3.实验结果
3.1 LC MS/MS数据分析
3.2 VHH纳米抗体克隆表达，纯化以及鉴定
3.3重组纳米抗体与原核CD47结合活性鉴定
3.4 重组纳米抗体VHH-737446与真核CD47结合活性鉴定
3.5 噬菌体筛选的阳性克隆序列与NGS数据库和质谱分析结果的序列比对
4.讨论
第五部分 结论和展望
结论
展望
参考文献
英文缩略词
参与课题及发表文章
发表文章
致谢
