共价连接AFP-β2m-HLA-A2/IgG1Fc二聚体的制备

摘要

表达在细胞膜上的MHC I类分子由三分子组成，MHCI类的重链（H链）、轻链（L链，即β2m）和抗原肽（antigenic peptide），形成抗原肽/MHC复合物（pMHC），其基本生物学功能是提呈抗原给CD8+T细胞表面的TCR识别。作为TCR的配体，pMHC多聚体已广泛应用于抗原特异性T细胞的检测及功能调控，其常见的形式为二聚体、四聚体、五聚体。pMHC二聚体是通过制备MHC与抗体Fc段的融合蛋白，通过Fc段铰链区的二硫健将两个MHC分子连接起来，再将MHC限制性抗原肽结合到MHC-Ig二聚体的抗原肽结合槽上,形成的pMHC二聚体能够与T细胞表面TCR更稳定的结合,可以体外诱导或抑制抗原特异性CTL的应答。
　　本实验室已构建不同的pMHC二聚体，尤其以HLA-A2二聚体为主，前期工作已证实可溶性HLA-A2/IgG1Fc二聚体在体外可以抑制同种反应性T细胞的应答。然而该二聚体的抗原肽、β2m和HLA-A2分子重链三者之间是非共价连接的，在体内环境下，这三者极易解离并被降解，不利于抗原特异性T细胞的制备和扩增。为了解决这个问题，我们将抗原肽、β2m和HLA-A2分子重链三者之间通过共价连接，组成共价连接的HLA-A2二聚体，其结构在体内更稳定，是肿瘤特异性T记忆性干细胞体内研究的有利工具。
　　在本实验室已构建β2m共价连接的HLA-A2/IgG1Fc二聚体表达载体的基础上，本课题将抗原肽（HLA-A2限制性甲胎蛋白抗原肽，hAFP158-166）和β2m基因通过共价连接重组到 HLA-A2/IgG1Fc基因片段中，表达共价连接AFP-β2m-HLA-A2/IgG1Fc二聚体，并鉴定其构象功能的正确性。
　　目的：制备共价连接的AFP-β2m-HLA-A2/IgG1Fc二聚体。
　　方法：1）pcDNA3.1+[AFP-β2m-HLA-A2/IgG1Fc]真核表达载体的构建；通过双酶切获取AFP-β2m基因和pcDNA3.1+[HLA-A2/IgG1Fc]载体，将AFP-β2m基因插入pcDNA3.1+[HLA-A2/IgG1Fc]载体中重组形成pcDNA3.1+[AFP-β2m-HLA-A2/IgG1Fc]真核表达载体；2）重组pcDNA3.1+[AFP-β2m-HLA-A2/IgG1Fc]载体转染中国仓鼠卵巢细胞CHO后表达共价连接AFP-β2m-HLA-A2/IgG1Fc二聚体，利用MHC I类分子构象依赖性抗体W6/32和抗人β2m抗体ELISA法检测其构象，通过抗人IgG1Fc抗体Western-Blot检测融合蛋白的分子量，HLA-A2构象性抗体BB7.2流式检测其IgG1Fc段的结合功能。
　　结果：菌液PCR、酶切鉴定均显示融合基因片段与预期值相符，基因测序比对结果与理论设计的基因序列完全吻合，表明成功构建了pcDNA3.1+[AFP-β2m-HLA-A2/IgG1Fc]真核表达载体；将该表达载体转染中国仓鼠卵巢细胞CHO，经400ug/ml的G418筛选获得稳定表达的细胞株，ELISA法测定其细胞上清中共价连接AFP-β2m-HLA-A2/IgG1Fc二聚体构象与理论一致，且其在CHO细胞中的表达量约为2ug/ml，Western-Blot测定该二聚体经SDS变性后分子量与预期值（约83KD）相符，BB7.2抗体流式检测显示该二聚体其IgG1Fc段能与HLA-A2阴性单核细胞表面的FcR结合。
　　结论：本课题成功制备了共价连接的AFP-β2m-HLA-A2/IgG1Fc二聚体，并为特异性T细胞的体内研究提供有利工具。

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英文缩略词表

中文摘要

英文摘要

前言

第一部分pcDNA3.1+[AFP-β2m-HLA-A2/IgG1Fc]真核表达载体的构建

材料和方法

结果

讨论

第二部分 共价连接AFP-β2m-HLA-A2/IgG1Fc二聚体的表达及鉴定

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

综述: 肿瘤适应性免疫治疗的研究进展

致谢