丙泊酚通过激活PI3K/Akt/GSK3β信号通路保护大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用依赖于Caveolin-3的表达

摘要

第一部分 Caveolin-3在丙泊酚预处理后心肌缺血再灌注损伤中的变化趋势
　　目的：研究caveolin-3在丙泊酚预处理后心肌缺血再灌注损伤中的变化。方法：建立雄性SD成年大鼠心肌缺血再灌注模型（缺血45min再灌注3h）及H9C2心肌细胞缺氧再灌注模型（缺氧6h再灌注2h）。本实验随机分为四组，n=10：对照组（CONTROL组），缺血再灌注组（SI/R组）或缺氧再灌注组（H/R组），丙泊酚+SI/R或 H/R组（PROPOFOL+SI/R组或 PROPOFOL+H/R组），DMSO+SI/R或 H/R组。PROPOFOL+SI/R组及DMSO+SI/R组分别于缺血（缺氧）前30min给予丙泊酚（在体：37.5mg/kg/h；离体：50umol/L）或DMSO（0.1％）预处理，再予以缺血再灌注处理。四组标本均提取总mRNA，实时定量PCR法检测caveolin-3的mRNA改变，大鼠心脏EB+TTC染色计算心肌梗死面积百分比，检测血清LDH水平，冰冻切片TUNEL法检测细胞凋亡指数，MTT法检测H9C2心肌细胞存活率，冰冻切片及H9C2细胞行caveolin-3荧光染色，Western blotting（WB）法检测caveolin-3,pPTEN,PTEN，pAkt473,pAkt308,tAkt,pGSK3β，tGSK3β,caspase-3及HIF-1α蛋白表达量的变化。结果：DMSO+SI/R组与SI/R组相比，各检测指标差异无统计学意义；PROPOFOL+SI/R组与SI/R组比较，心肌梗死面积百分比减少（32.75±3.70% vs50.31±1.67%,P<0.05），血清LDH水平降低，TUNEL染色示心肌细胞凋亡率下降（14.68±1.50% vs33.88±2.16%,P<0.002），MTT法示心肌细胞存活率增加（73.64±2.97% vs61.24±6.52%,P<0.05），WB检测示caveolin-3表达量增加（细胞0.46±0.07 vs0.17±0.04,P<0.01；组织0.99±0.07 vs0.38±0.07,P<0.002），pAkt473/tAkt、pAkt308/tAkt、pGSK3β/tGSK3β比值均增加（P<0.05），caspase-3表达减少，HIF-1α表达增加；与CONTROL组相比，H/R组荧光半定量示caveolin-3膜上分布减少，胞质表达增加（膜蛋白/总蛋白0.09±0.06 vs0.35±0.13,P<0.05），与H/R组相比，PROPOFOL+H/R组caveolin-3膜上表达量增加（膜蛋白/总蛋白0.33±0.10 vs0.09±0.06,P<0.05）；四组间实时定量PCR示caveolin-3 mRNA水平差异无统计学意义。结论：心肌缺血再灌注时丙泊酚预处理可激活 PI3K/Akt/GSK3β信号通路，增加 caveolin-3的膜蛋白表达量，且不改变其mRNA水平。
　　第二部分 MβCD破坏Caveoae结构后对丙泊酚预处理在心肌缺氧复氧损伤保护作用中的影响
　　目的探讨用MβCD破坏caveolae结构对丙泊酚预处理所致心肌缺氧复氧损伤保护作用的影响。方法甲基倍他环糊精（MβCD）可破坏caveolae结构，于丙泊酚或DMSO给药前30min给予10mmol/L MβCD处理，观察caveolin-3结构破坏后对丙泊酚预处理所致心肌保护作用及PI3K/Akt/GSK3β通路的影响。将H9C2心肌细胞接种后随机分为8组，n=5：CONTROL组，H/R组，PROPOFOL+H/R组，DMSO+H/R组，MβCD+CONTROL组，MβCD+H/R组，MβCD+PROPOFOL+H/R组，MβCD+DMSO+H/R组。MTT法比较各组间细胞存活率，同时 WB检测 caveolin-3，pAkt473,pAkt308,tAkt,pGSK3β,tGSK3β蛋白表达情况。结果用MβCD破坏caveolae结构后，MβCD+CONTROL组与CONTROL组、MβCD+H/R组与H/R组、MβCD+DMSO+H/R与 DMSO+H/R组比较，细胞存活率差异均无统计学意义；与PROPOFOL+H/R组相比，MβCD+PROPOFOL+H/R组细胞存活率下降（57.68±12.91%vs83.19±4.44%,P<0.002）；WB结果显示，与CONTROL组相比，MβCD+CONTROL组caveolin-3表达减少（0.16±0.03 vs0.81±0.09,P<0.002），pAkt473/tAkt、pAkt308/tAkt、pGSK3β/tGSK3β比值均减少（P<0.05）；与 PROPOFOL+H/R组相比，MβCD+PROPOFOL+H/R组caveolin-3表达减少（0.24±0.05 vs0.70±0.14,P<0.01），pAkt473/tAkt、 pAkt308/tAkt、 pGSK3β/tGSK3β比值减少(P<0.05)。结论 MβCD破坏caveolae结构后，caveolin-3表达减少，PI3K/Akt/GSK3β信号通路蛋白磷酸化水平下降，丙泊酚预处理所致心肌缺氧复氧损伤保护作用减弱。
　　第三部分通过抑制Caveolin-3降解观察其对PI3K/Akt/GSK3β信号通路的影响
　　目的研究心肌缺氧复氧时caveolin-3的降解被抑制后，丙泊酚预处理对缺氧复氧损伤保护作用的影响。方法蛋白体酶抑制剂MG132可抑制caveolin-3的降解，含MG132组各组给予20umol/L MG132处理30min，观察其对caveolin-3、PI3K/Akt/GSK3β信号通路及细胞存活率的影响。将H9C2心肌细胞接种后分为5组，n=5： CONTROL组，H/R组，PROPOFOL+H/R组，MG132+H/R组，MG132+PROPOFOL+H/R组。WB检测 caveolin-3,pAkt473,pAkt308,tAkt,pGSK3β，tGSK3β蛋白表达情况。结果 WB结果示，与H/R组相比，MG132+H/R组caveolin-3表达明显增加（1.00±0.12 vs0.49±0.11,P<0.01），pAkt473/tAkt、pAkt308/tAkt、pGSK3β/tGSK3β比值增加(P<0.05)，同时细胞生存率增加（P<0.05）；与PROPOFOL+H/R组相比，MG132+PROPOFOL+H/R组各蛋白表达量差异无统计学意义、细胞存活率组间差异无统计学意义。结论心肌缺血再灌注时caveolin-3的下降与其经蛋白体酶途径降解增多有关，并且 caveolin-3表达量的变化影响PI3K/Akt/GSK3β信号通路各蛋白表达水平；丙泊酚对心肌缺氧复氧损伤的保护作用与其抑制caveolin-3的降解有关。

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英文缩略词

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英文摘要

前言

参考文献

实验总体框架

第一部分 Caveolin-3在丙泊酚预处理后心肌缺血再灌注损伤中的变化趋势

引言

材料与方法

实验结果

讨论

参考文献

第二部分 MβCD破坏Caveoae结构后对丙泊酚预处理在心肌缺血再灌注损伤保护作用中的影响

引言

材料与方法

实验结果

讨论

参考文献

第三部分 通过抑制Caveolin-3降解观察其对PI3K/Akt/GSK3β信号通路的影响

引言

材料与方法

实验结果

讨论

参考文献

全文总结

致谢