中国儿童期重症肌无力临床免疫特点及发病机制研究

摘要

第一部分中国儿童期重症肌无力临床免疫特点研究
　　目的：通过回顾性和前瞻性研究，总结归纳中国儿童期重症肌无力的临床及免疫学特点。
　　方法：本研究首先采用回顾性研究方法，回顾分析了在华中科技大学同济医院门诊就诊的4219名重症肌无力患者的临床资料（1982年1月至2010年7月），对病人的性别、发病年龄、临床分型、胸腺及甲状腺功能情况等进行了统计分析。随后，我们随机选择104名儿童期重症肌无力患者和100名健康对照进行了前瞻性研究（2011年1月至2013年6月在我科门诊就诊）。随访主要是通过在门诊就诊过程中的评估、家庭走访、电话跟踪和病历回顾完成。临床分级主要通过Osserman分级来进行。临床症状及疗效评判时间点分别为首诊、治疗后2周、4周、3个月、6个月、12个月和最后一次就诊，通过美国重症肌无力协会重症肌无力评价量表（Myasthenia Gravis Foundation of America Quantitative MG scale，Q-MG，0-39分）、Osserman量表、日常活动量表（Activities of daily living scoring system，MG-ADL，24分）以及肌力量表（Manual muscle testing，MMT）来评价。相关辅助检查，如胸部MRI/CT平扫、甲状腺功能检测（FT3、FT4、TSH）、及免疫全套（IgG、IgA、IgM，C3、C4）等于首次就诊时在同济医院检验科进行，有条件的患者在之后随访中也按需进行。采集了患者及对照组儿童的外周血，利用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测外周血血清中乙酰胆碱受体抗体（AChRAb）水平，利用定量抗体芯片技术对血清中IgG亚型进行分析。
　　结果：回顾性研究发现51.22％的重症肌无力患者在儿童期发病。前瞻性研究中，儿童期重症肌无力患儿的AChRAb阳性率为69.2%。与正常对照相比，儿童期重症肌无力患儿血清IgG，IgA，IgM，C3及C4水平均有显著性降低（P<0.05）；IgG亚型分析中，IgG1和IgG3水平高于对照组（P<0.05），其余亚型无统计学差异（P>0.05）。与免疫抑制治疗前相比较，Q-MG量表及Osserman量表评分在治疗后3、6、12个月及最后一次随访时均有明显改善（P<0.05）；MG-ADL量表评分在治疗后3、6、12个月也有显著下降（P<0.05）；MMT量表在治疗后6个月和12个月有明显改善（P<0.05）。
　　结论：我们的研究结果表明，中国儿童期重症肌无力在全部重症肌无力中所占的比例较其他国家及地区明显高，本研究中发现中国儿童期重症肌无力患者AChRAb阳性率高，免疫球蛋白及补体异常，免疫抑制剂治疗有效，提示其为自身免疫反应介导的自身免疫性疾病。
　　第二部分中国儿童期重症肌无力发病机制探讨
　　目的：通过前瞻性研究，对中国儿童期重症肌无力的可能发病机制进行探讨。
　　方法：本研究中，我们随机选取了104名儿童期重症肌无力患者和100名健康对照进行了前瞻性研究（于2011年1月至2013年6月在同济医院神经内科门诊就诊）。采集了患者及对照组儿童的外周血，送往同济医院儿科病毒实验室，检测外周血病毒感染全套(抗巨细胞病毒/风疹病毒/弓形虫/单纯疱疹病毒I/单纯疱疹病毒II-IgM/IgG以及抗埃可病毒/细小病毒19/EB病毒/柯萨基病毒-IgM的含量)和常见呼吸道感染病原体（Q立克次体/肺炎衣原体/呼吸道合胞病毒/流感病毒A/流感病毒B/副流感病毒）的IgM抗体含量；利用ELISA方法检测外周血血清中IL-17A，IL-23以及IL-12/23p40的表达水平；利用iTRAQ蛋白组学技术筛选两组之间的免疫相关差异蛋白，并通过ELISA的方法对筛选出的差异蛋白进行进一步确定。同时，我们还在病理科搜取了行胸腺切除术重症肌无力患儿的胸腺石蜡标本作为病例组，取进行校正性心血管手术的非重症肌无力患儿胸腺标本作为正常对照组，进行HE染色，CD20及CD21免疫组织化学染色。
　　结果：前瞻性研究中，与正常对照组相比，重症肌无力患儿组的外周血病毒感染全套中各项指标均无显著性差异（P>0.05）；重症肌无力患儿外周血血清中IL-17A，IL-23以及IL-12/23p40的表达水平较对照组均明显升高（P<0.05）；通过两次iTRAQ蛋白组学检测（初筛检测和确认检测），筛选出血清免疫学相关差异蛋白Properdin，其在重症肌无力患儿组的含量显著高于正常对照组（P<0.05），随后我们为了进一步确认其可靠性，进行了外周血血清Properdin ELISA验证，与健康对照相比，中国儿童重症肌无力患儿血清中Properdin含量明显高于健康对照（P<0.05），与iTRAQ蛋白组学结果一致。胸腺免疫组织化学染色所见：与正常对照相比，重症肌无力患儿的胸腺并未表现出明显的增生。但是，重症肌无力患儿胸腺可观察到明显CD20+CD21+染色反应。
　　结论：本研究中，重症肌无力患儿外周血IL-17A，IL-23以及IL-12/23p40的水平升高；重症肌无力患儿胸腺免疫组织化学染色可观察到明显B细胞活化，聚集成生发中心；重症肌无力患儿外周血Properdin水平升高，上述均提示中国儿童期重症肌无力的发病与Th17细胞、胸腺B细胞及补体旁路激活途径功能异常密切相关。且本研究尚未发现中国儿童期重症肌无力的发病与病毒感染相关的证据，故而我们认为免疫异常，包括Th17细胞功能异常、胸腺功能缺陷以及补体旁路激活途径异常等，在中国儿童期重症肌无力的发病机制中起到决定性作用。Properdin可能成为今后儿童期重症肌无力分子靶向治疗的潜在靶点。

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第一部分中国儿童期重症肌无力临床免疫特点研究

中 文 摘 要

ABSTRACT

1.绪 言

2.材 料 与 方 法

2.1 研究对象

2.2实验材料

2.3 实验方法

2.3 统计学分析

3.实 验 结 果

3.1中国儿童期重症肌无力的临床特点分析

3.2中国儿童期重症肌无力免疫学指标检测结果

4.讨 论

参 考 文 献

第二部分中国儿童期重症肌无力发病机制探讨

中 文 摘 要

ABSTRACT

1. 绪 言

2.材 料 与 方 法

2.1 研究对象

2.2 实验材料

2.3 关键试剂配制

2.4 实验方法

2.4 统计学分析

3.实 验 结 果

3.1中国儿童期重症肌无力患者外周血白介素ELISA检测结果

3.2 中国儿童期重症肌无力外周血常见病毒感染全套及呼吸道病原体感染全套检测

3.3 中国儿童重症肌无力血清免疫差异蛋白研究结果

4.讨 论

参 考 文 献

附 录一重症肌无力评分量表

附 录二攻读学位期间发表论文

附 录三 综述: 重症肌无力补体系统相关发病机制的研究进展

致谢