MiR-548ac/Notch1信号通路在胰腺癌中的作用研究

摘要

目的：
　　胰腺癌目前仍是人类恶性程度最高的癌症之一，由于缺乏有效的早期诊断手段，大多病例被发现时已是晚期。传统手术及化疗等手段对胰腺癌的治疗没有重大进展。因而迫切需要明确胰腺癌的发病机制。MicroRNAs已经被广泛证明调控多种肿瘤的生物学事件，包括胰腺癌。MiR-548ac属于miR-548家族，该家族被报道参与肿瘤的发生发展，但具体的机制仍不清楚。miR-548ac在胰腺癌中未曾被研究，其在胰腺癌中的作用尚不明确。因此，本研究主要探讨miR-548ac在胰腺癌中的作用，并进一步研究其可能的调控机制。
　　方法：
　　采集在2012年7月至2015年2月期间在武汉协和医院胰腺外科行手术治疗的50例胰腺癌患者病例及组织标本（其中男性患者24例,女性患者26例）。通过qRT-PCR检测胰腺癌组织中miR-548ac及Notch1的相对表达量，进一步分析这两者之间的相关性。构建双荧光素酶报告基因载体，共转染miR-548ac的类似物，观察胰腺癌细胞系中miR-548ac对Notch1直接作用关系。
　　细胞转染使用脂质体2000作为载体，将miR-548ac类似物转染至PANC-1和BxPC-3细胞中。运用实时荧光定量PCR检测miR-548ac的表达，分析转染效率。Western blot检测Notch1蛋白水平的变化。通过MTT法检测胰腺癌细胞在活体外的增殖。皮下种植瘤模型观察胰腺癌细胞的成瘤能力。细胞的侵袭能力的检测采用Transwell实验法。
　　结果：
　　qRT-PCR检测发现miR-548ac在50例胰腺癌组织和4个胰腺癌细胞系中表达明显低于癌周正常胰腺组织或正常胰腺导管上皮细胞。miR-548ac的表达下调与肿瘤体积、临床分期、淋巴结侵袭和远处转移呈正相关。胰腺癌细胞行为学研究显示增加miR-548ac的表达能明显抑制胰腺癌细胞的增殖，减弱胰腺癌细胞裸鼠体内成瘤能力。同时，miR-548ac能明显抑制胰腺癌细胞的迁徙和侵袭。双荧光素酶报告实验显示miR-548ac mimics能明显降低Notch1的野生型3’UTR的荧光素酶活性，说明miR-548ac与Notch1 mRNA的3’UTR能够直接相作用。Notch1在胰腺癌组织中高表达，且这种高表达同miR-548ac在胰腺癌中的低表达呈负相关性。胰腺癌细胞上调miR-548ac的表达，能够降低Notch1在mRNA和蛋白的表达水平，显示miR-548ac靶向调控Notch1。进一步干扰Notch1的表达，胰腺癌细胞呈现与miR-548ac过表达相同的结果。
　　结论：
　　miR-548ac胰腺癌细胞内靶向调控Notch1的表达。miR-548ac/Notch1通路能够抑制胰腺癌细胞的增殖、成瘤能力、侵袭转移，在胰腺癌细胞中的发挥抑癌作用。靶向调控miR-548ac/Notch1通路表达可成为胰腺癌诊断与治疗的新靶点。