作为新型肝癌靶向载体的双配体壳聚糖纳米颗粒的体内分布和生物相容性

摘要

目的：明确经甘草次酸修饰的半乳糖化壳聚糖纳米颗粒（GCGA NPs）在生物体内的分布及其对肝癌（HCC）细胞的靶向效率，进一步评估该纳米颗粒的细胞毒性和生物相容性。
　　方法：遵循先前报道的两步酰胺化反应合成GACS NPs和GCGA NPs，并通过化学反应修饰异硫氰酸荧光素（FITC）。采用场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）来观测纳米颗粒的形态和大小，用Zetasizer3000HS仪器系统测量其粒径。通过设置体外细胞摄取实验，在共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）下观察比较三种纳米颗粒（GCGA、GACS、CS NPs）对HepG2细胞的靶向能力以及GCGA NPs对HepG2细胞和人正常肝细胞LO2的亲和力。以CCK-8法来测试不同浓度的GCGA NPs对HepG2的细胞毒性。用体外溶血试验评估纳米颗粒的血液相容性。采用肝脏隧道嵌入法构建H22细胞小鼠原位肝癌模型，用FITC标记的荧光纳米颗粒溶液经尾静脉注射小鼠，以追踪不同时间点该纳米载体在生物体内的分布，进一步验证其对高表达甘草次酸（GA）和乳糖醛酸（LA）受体的肝癌组织的高靶向性。通过检测经GCGA NPs处理过的SD大鼠的体重、血常规和血生化指标，并镜下观察其主要器官的HE染色标本，来评估该纳米颗粒的生物相容性。
　　结果：参考已报道的合成方法成功制备出GCGA、GACS、CS NPs，并标记了FITC。FE-SEM图片显示三者均呈球形，单分散性，大小均一，平均粒径约为60nm。动态光散射（DLS）检测其平均粒径分别为93.8nm、90.3nm和94.0nm。在相同条件下，来自GCGA NPs共聚焦图片荧光强度比其他两种纳米颗粒更强，并且HepG2细胞内的绿色荧光相较于缺乏靶向受体的LO2细胞也有显著的增强。细胞毒性实验表明GCGA NPs在浓度低于50ug/mL时对HepG2的无明显的细胞毒性。这种纳米颗粒即使在最高浓度（300ug/mL）下孵育红细胞3h也没有呈现出明显的溶血现象，经t检验分析可知上清液的光密度值（OD值）与对照组比较无统计学差异（P>0.05）。不管是在注射后4h还是24h，小鼠原位肝癌模型的肿瘤组织摄取FITC-GCGA NPs的相对量是在所有组织中最高的。与阴性对照组相比，经GCGA NPs处理过的SD大鼠的体重、血常规和血生化指标在各时间点均无统计学差异（P>0.05）,而且各主要器官的HE染色切片中也没有呈现出明显的病理学改变。
　　结论：GCGA NPs是一种非常安全、有效的肝癌靶向药物载体，有望在未来肝细胞癌的靶向药物治疗领域发挥重要的作用。