应用RNAi技术沉默基因P21对乳腺癌细胞MCF-7中IKK/IKB/NF-KB信号的影响

摘要

目的:
　　探讨通过siP21干扰人乳腺癌细胞株MCF-7细胞后对增殖、药敏、侵袭的影响以及对IKK/IKB/NF-KB通路表达的影响。
　　方法:
　　1、培育人乳腺癌细胞株MCF-7细胞，选取对数生长期状态优良的细胞，经由脂质体为载体把siP21导入MCF-7细胞。
　　2、转染后提取蛋白并经由Western-blot方法对P21基因的表达进行检测。
　　3、转染后培养细胞并在不同时间点经由MTT法检测细胞增殖；同法测阿霉素药敏。
　　4、将转染后细胞种植入Transwell小室，检测细胞侵袭力。
　　5、转染后提取蛋白并经由Western-blot方法检测NF-kB信号通路。
　　结果:
　　1、通过siP21干扰人乳腺癌细胞株MCF-7细胞后，Western-blot结果表明，siP21转染组相较于阴性对照组细胞，表达P21蛋白量明显下降（P<0.05）。
　　2、MTT法检测显示在细胞转染后，siP21转染组细胞的吸光值在四个梯度时间点分别为（0.63±0.004）、（0.70±0.003）、（0.87±0.005）、（1.32±0.004）。阴性对照组细胞的吸光值在四个时间点分别为（0.60±0.002）、（0.65±0.003）、（0.84±0.003）、（1.39±0.002）。可见转染后细胞生长情况无明显差异。
　　3、MTT法检测显示在细胞转染后，siRNA转染组的细胞在不同浓度阿霉素作用72h之后计算出IC50值为1.513μg/ml。阴性对照组的细胞在不同浓度阿霉素作用之后计算出IC50值为1.530μg/ml。可见转染后细胞阿霉素药敏情况差异不大。
　　4、Transwell检测细胞侵袭力实验中,siRNA转染组细胞穿膜细胞数（26.7±8.50）,阴性对照组细胞穿膜细胞数（325.7±38.50）,二者之间有统计学意义上的差异（P＜0.05）。
　　5、Western印迹法显示表明，siRNA转染组与阴性对照组相比，IKBa、IKKb、NF-KB蛋白表达量差异无统计学意义（P＞0.05），P-NFKB蛋白表达量有统计学意义上的差异（P＜0.05）。
　　结论:
　　1、经过siP21干扰，人乳腺癌细胞株MCF-7细胞中P21蛋白的表达可以被有效抑制。
　　2、下调P21并不影响人乳腺癌细胞株MCF-7细胞的增殖能力及及其对阿霉素的药物敏感性，靶向P21在乳腺癌化疗过程中的意义可能不大。
　　3、下调P21可降低乳腺癌MCF-7细胞侵袭能力，靶向P21可能减少乳腺癌转移，进而改善乳腺癌患者预后。
　　4、下调P21可降低乳腺癌MCF-7细胞NF-KB磷酸化水平。结合调控P21和NF-KB通路可能是乳腺癌患者潜在而有前途的治疗目标。

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目录

1 绪 论

1. 1 乳腺癌流行病学

1.2 P21基因

1.3 NF-KB通路

1. 4本研究的目的和意义

2 主要实验技术及其原理

2. 1 细胞的培养：细胞复苏、传代与保种

2. 2细胞计数

2.3 MTT分析法

2. 4脂质体介导R NA干扰技术

2. 5BC A蛋白定量法

2.6SDS-PAGE电泳

2. 7 免疫印迹技术

2.8 TRANSWELL技术

3 材料与方法

3. 1 实验材料

3. 2 实验方法与步骤

4 实验结果

4.1 转染siP21干扰激素受体阳性的MCF-7细胞株后靶蛋白P21的表达情况

4.2转染 si P21 干扰激素受体阳性的MCF-7细胞株后其增殖转变情况

4.3转染 si P21 干扰激素受体阳性的MCF-7细胞株后其对阿霉素药敏的影响

4.4转染 si P21干扰激素受体阳性的MCF-7细胞株后侵袭力转变情况

4.5转染 si P21干扰人乳腺癌细胞株MCF-7细胞后NF-KB通路蛋白表达变化情况

5讨论与展望

5. 1讨论

5. 2展望

致谢

参考文献

附录 主要缩略词表

综述:P21和肿瘤的发生