1.DAB2IP抑制结直肠癌侵袭转移的功能与机制研究；2.胃癌系膜转移（第五转移）的规律及其预后研究

摘要

课题1.DAB2IP抑制结直肠癌侵袭转移的功能与机制研究
　　第一部分：DAB2IP调控结直肠癌EMT及CSC特性
　　目的：明确DAB2IP在人结直肠癌中调控EMT及CSC特性的生物学功能。
　　方法：构建稳定敲减和高表达DAB2IP的结直肠癌细胞株及其对照组细胞株，体外通过蛋白免疫印迹和RT-PCR实验比较以上稳定细胞株EMT相关蛋白和基因的表达变化；Real Time PCR实验检测以上稳定细胞株的CSC标志物和相关转录因子的表达，软琼脂克隆形成实验比较稳定株细胞非贴壁依赖性性生长情况，球体形成实验比较以上稳定株细胞球体形成的数量及大小，利用细胞凋亡检测实验比较稳定株细胞对化疗药物奥沙利铂和5-Fu的敏感性；有限稀释实验比较稳定株细胞在裸鼠体内的成瘤能力，免疫组化检测异种移植瘤、DAB2IP敲除小鼠结肠组织和临床结直肠癌正常、原发灶以及肝转移灶的上皮标志物E-cadherin和肿瘤干细胞（CSC）标志物CD44的表达，流式细胞术检测31例结直肠癌患者新鲜肿瘤标本中CD133＋细胞的比例；最后，通过裸鼠脾脏被膜下注射肿瘤细胞肝转移模型比较稳定敲减DAB2IP的结直肠癌细胞和对照组细胞的肝转移能力。
　　结果：外源性高表达DAB2IP可以明显抑制结直肠癌细胞EMT和CSC相关蛋白和基因的表达，相反内源性敲减DAB2IP可以明显促进结直肠癌细胞EMT和CSC相关蛋白和基因的表达；软琼脂克隆形成实验和球体形成实验都表明DAB2IP明显抑制软琼脂和球体形成的数量和大小，细胞耐药实验表明DAB2IP的表达下调都可以显著降低结直肠癌细胞对化疗药物奥沙利铂和5-Fu的敏感性；有限稀释试验表明DAB2IP的缺失可以明显增强结直肠细胞的肿瘤形成能力;在异种移植瘤中，HT29-KD6和HCT116-KD2细胞所形成的移植瘤的上皮标志物E-cadherin的表达较对照组细胞HT29-shcon和HCT116-shcon形成的移植瘤明显下降，但CSC标志物CD44的表达则增加；在DAB2IP敲除小鼠的结肠组织标本中，DAB2IP敲除的小鼠结肠组织较野生型小鼠结肠组织的E-cadherin表达下降，间质标志物Snail、Slug和CSC标志物CD44表达则增加；在临床结直肠癌正常、原发灶和肝转移灶标本中DAB2IP和E-cadherin的表达呈逐渐递减的趋势，而间质标志物Snail、Slug和CSC标志物CD44表达则逐渐增强；通过流式细胞术检测31例结直肠癌患者新鲜肿瘤标本中CD133＋细胞的比例后发现：结直肠癌患者肿瘤灶DAB2IP低表达可以富集更多的CD133＋肿瘤干细胞。最后，在裸鼠肝转移模型中，结直肠癌细胞DAB2IP的表达下降可以增强其肝转移能力。
　　结论：DAB2IP可以在体内、外抑制结直肠癌细胞EMT和CSC特性；DAB2IP的表达下调可以促进结直肠癌细胞转移。
　　第二部分：DAB2IP调控结直肠癌EMT和CSC特性的机制研究
　　目的：探究DAB2IP调控结直肠癌EMT和CSC特性的可能机制。
　　方法：提取稳定高表达 DAB2IP细胞（SW480）和敲减 DAB2IP细胞（HT29和 HCT116）的胞浆胞核蛋白，蛋白免疫印迹实验检测 p65在细胞核的表达；双荧光素酶报告实验检测以上三对稳定株细胞的NF-κB的转录活性；利用siRNA干扰技术分别干扰IκB或p65后检测NF-κB的转录活性、EMT相关蛋白的表达和肿瘤细胞的球体形成能力，观察能否逆转 DAB2IP调控结直肠癌EMT和 CSC特性的效应；此外，免疫组化检测裸鼠皮下异种移植瘤、敲除DAB2IP的转基因小鼠的结肠组织和临床结直肠癌标本中p65和IκB-α的表达。
　　结果：与它们相应的对照组细胞相比，细胞核中p65在SW480-D2细胞中表达下降，在HT29-KD5和HCT116-KD3细胞中表达都增加；双荧光素酶报告实验结果表明DAB2IP可以抑制NF-κB的转录活性；在SW480-D2细胞中干扰IκB-α的表达可以逆转 DAB2IP对 NF-κB转录活性的抑制效应，在 HT29和HCT116细胞中干扰p65可以逆转DAB2IP表达下降对NF-κB转录活性的激活效应；同样的处理方法还能逆转DAB2IP对EMT相关蛋白的调控作用以及对细胞体外球体形成能力的影响；在裸鼠皮下形成的异种移植瘤中，我们还发现DAB2IP的表达下调可以促进结直肠癌细胞（HT29-KD6和HCT116-KD2）p65的入核和IκB-α的出核，在敲除DAB2IP的转基因小鼠和临床结直肠癌标本中也发现这一现象。
　　结论：DAB2IP调控结直肠癌EMT和CSC特性的作用是通过NF-κB信号介导的。
　　第三部分：DAB2IP低表达影响结直肠癌患者预后
　　目的：明确DAB2IP的表达与结直肠癌患者预后的关系。
　　方法：我们首先通过免疫组化分析比较同一张石蜡包埋组织切片中结直肠癌组织、癌旁正常组织以及肿瘤侵袭前沿部位和肿瘤中心部位DAB2IP的表达，我们还在162例结直肠癌标本、100例癌旁正常组织和62例转移组织（57例淋巴结转移和5例肝转移）中分析DAB2IP的表达规律；此外，我们还进一步分析了162例结直肠癌患者 DAB2IP的表达与临床病理因素的关系，利用Kaplan-Meier生存分析DAB2IP的表达与结直肠癌患者预后的关系；
　　结果：我们发现在同一张石蜡包埋组织切片中结直肠癌组织DAB2IP的表达明显较正常组织表达低，且肿瘤侵袭前方部位较肿瘤中央部位DAB2IP表达明显降低；在我们收集的结直肠肿瘤临床标本中发现只有8％患者（8/100）的正常结肠组织DAB2IP低表达或不表达，92%患者（92/100）DAB2IP中、高表达，在结直肠癌组织中有62.3%（101/162）患者DAB2IP低表达或不表达，而在转移灶中低表达或不表达DAB2IP的患者比例高达80.6%（50/62）；进一步统计分析DAB2IP与患者的临床病理因素关系发现：低表达DAB2IP与肿瘤分化程度（P=0.004）和转移(P=0.034)密切相关；此外，Kaplan-Meier生存分析发现低表达 DAB2IP结直肠癌患者5年预后明显差于高表达 DAB2IP结直肠癌患者（P=0.001）。
　　结论：DAB2IP可以作为一个重要的预测结直肠癌患者预后的指标，DAB2IP低表达促进结直肠癌进展。
　　课题2.胃癌系膜转移（第五转移）的规律及其预后研究
　　第一部分：胃癌系膜转移（第五转移）的检测及其规律
　　目的：检测胃癌患者系膜转移（第五转移）的发生及其规律。
　　方法：对胃癌患者术后胃系膜标本进行大规模连续切片并通过H&E染色和免疫组化分析证实胃癌系膜转移（第五转移）的存在及其发生率；此外，通过分析第五转移和患者临床病理因素的关系得出第五转移的一般规律。
　　结果：我们在74例胃癌患者胃系膜中发现9例患者存在胃癌系膜转移（第五转移），总体发生率为12.2%（9/74），其中在40例早期胃癌患者中发现1例（发生率2.5%）存在系膜转移（第五转移），在34例进展期胃癌患者中发现8例（发生率23.5%）存在系膜转移（第五转移）；此外，系膜转移（第五转移）灶距离胃壁平均距离为2.6cm;系膜转移（第五转移）的发生与肿瘤的侵犯深度呈正相关（P=0.001），与淋巴结转移数目也呈显著的正相关性（P=0.001），但与患者的性别、年龄、肿瘤大小和肿瘤的分化程度没有明显的相关性。
　　结论：通过大规模连续切片分析可检测出早期和进展期胃癌患者存在第五转移，且其发生率随着肿瘤的侵犯深度和淋巴结转移个数的增加而增加。
　　第二部分：胃癌系膜转移（第五转移）与患者预后的关系
　　目的：明确胃癌第五转移是否影响患者预后。
　　方法：定期随访胃癌患者并利用Kaplan-Meier生存曲线分析比较胃癌第五转移阳性患者和阴性患者之间的3年生存率；单变量分析影响胃癌患者预后的临床病理因素；多变量分析明确胃癌第五转移是否能作为判断胃癌患者预后的一个独立指标。
　　结果：通过病例随访和Kaplan-Meier生存曲线分析后发现第五转移阳性胃癌患者的3年生存率明显低于第五转移阴性胃癌患者（P=0.0006）；此外，在T3分期胃癌患者中，第五转移阳性患者的3年生存率也显著低于阴性患者（P=0.004），在临床肿瘤分期为Ⅱ期的患者中也发现类似的结果。单变量分析发原发肿瘤灶大小（P=0.02）、Laurén分型(P=0.01)和第五转移（P=0.002）都与患者预后相关；多变量分析表明第五转移可以作为预测胃癌预后的一个独立指标。
　　结论：胃癌第五转移影响患者预后，且能作为预测胃癌预后的一个独立指标。

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封面

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课题1.DAB2IP抑制结直肠癌侵袭转移的功能与机制研究

前言

第一部分：DAB2IP调控结直肠癌EMT及CSC特性

摘要

Abstract

材料与方法

实验结果

讨论

第二部分：DAB2IP调控结直肠癌EMT和CSC特性的机制研究

摘要

Abstract

材料与方法

实验结果

讨论

第三部分：DAB2IP低表达影响结直肠癌患者预后

摘要

Abstract

材料与方法

实验结果

讨论

参考文献

课题2. 胃癌系膜转移（第五转移）的规律及其预后研究

前言

第一部分：胃癌系膜转移（第五转移）的检测及其规律

摘要

Abstract

材料与方法

实验结果

讨论

第二部分：胃癌系膜转移（第五转移）与患者预后的关系

摘要

Abstract

材料与方法

实验结果

讨论

参考文献

综述: 上皮间质转化与肿瘤干细胞

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