miR-221/222对PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活及其对多发性骨髓瘤的影响机制研究

摘要

本文分为两个部分进行探讨：
　　第一部分 miR-221/222作用于PTEN发挥对PI3K/AKT/mTOR信号通路的调控作用
　　目的：研究miR-221/222在不同人多发性骨髓瘤（MM）细胞系内的表达情况及其靶向作用于PTEN，从而发挥对PI3K/AKT/mTOR信号通路的调节作用。
　　方法：采用qRT-PCR法检测人MM细胞系NCI-H929、U266、OPM-2、MM.1S、MM.1R、RPMI8226、ARH-77等多个细胞系miR-221/222的表达情况；设计合成miR-221/222特异性模拟物miR-221/222 mimics和特异性抑制物miR-221/222 inhibitor，对miR221/222低表达细胞系（MM.1S）以及高表达细胞系（OPM-2等）分别转染miR-221/222 mimics/inhibitor，实验设置阴性对照转染组、正常对照组、miR-221/222 mimics/inhibitor转染组；qRT-PCR法检测转染后miR-221/222表达量；PI3K活性定量检测法检测PI3K活性变化；Western blot检测AKT、mTOR及p-AKT和p-mTOR蛋白的表达。
　　结果：（1）miR-221/222在OPM-2细胞系中高表达，MM.1S细胞系中低表达；（2）miR-221/222 mimics能在不影响其它非编码小RNA表达的情况下有效的上调miR-221/222在细胞系MM.1S中的表达量；miR-221/222 inhibitor则能有效的下调miR-221/222在MM.1R和OPM-2细胞系中的表达量；（3）上调miR-221/222后，PI3K活性、p-AKT和p-mTOR蛋白表达量明显上调，总AKT和mTOR的表达量未见明显变化；（4）相反，下调miR-221/222的表达量后，PI3K活性及p-AKT和p-mTOR表达明显下调，总AKT和mTOR表达无明显变化。
　　结论：异常过表达的miR-221/222可通过靶向作用于PTEN基因从而上调PI3K活性，进而使下游AKT和mTOR的磷酸化水平上调，通过拮抗该异常表达的miR-221/222可降低PI3K/AKT/mTOR信号通路的磷酸化水平。
　　第二部分 miR-221/222靶向作用于PTEN发挥对PI3K/AKT/mTOR信号通路调控及其多发性骨髓瘤细胞的凋亡与周期影响
　　目的：利用表达/拮抗试验观察在人MM细胞系中不同miR-221/222表达情况对MM细胞凋亡及周期的影响，并进一步探讨其机制。
　　方法:设计合成miR-221/222特异性模拟物miR-221/222 mimics和特异性抑制物miR-221/222 inhibitor，用miR-221/222 mimics转染MM.1S使其miR-221/222的表达水平上调，以及miR-221/222 inhibitor转染 MM.1R使其miR-221/222表达水平下调，实验设置阴性对照转染组、正常对照组、miR-221/222 mimics/inhibitor转染组，转染24小时后给予药物（雷帕霉素）；qRT-PCR法检测转染后miR-221/222表达量；PI3K活性定量检测法检测PI3K活性变化情况；Western blot检测miR-221/222表达量对AKT、mTOR等信号通路蛋白表达水平的影响；利用CCK-8检测miR-221/222表达量对MM细胞系的增殖影响；采用Annexin VFITC/PI双染法流式细胞仪检测miR-221/222过表达或抑制对MM细胞凋亡的影响；采用碘化丙啶（PI）单染法流式细胞仪检测miR-221/222过表达量对MM细胞周期的影响。
　　结果：（1）下调miR-221/222的表达可以明显抑制MM.1R细胞增殖能力，能诱导MM细胞凋亡，并促其向S期转变；（2）上调miR-221/222的表达后能促进MM.1S细胞的增殖，减少其凋亡,并诱导其向G0/G1期转变；（3）下调miR-221/222联合PI3K/AKT/mTOR通道抑制剂（雷帕霉素）作用于MM细胞系可以更有效地抑制肿瘤细胞的增殖，并且能够减低药物的IC50；（4）雷帕霉素不仅可以作为mTOR的抑制剂，同时也可以抑制PI3K的活性，从而诱导MM细胞凋亡；
　　结论：沉默miR-221/222的表达能够抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活，使其磷酸化水平降低，从而抑制骨髓瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡以及阻滞细胞周期，最终抑制骨髓瘤细胞的生长；此外，下调miR-221/222表达水平能减低抗MM药物的IC50，从而避免大剂量化疗药的相关毒副作用。