BRIT1-Mus81-BIR调控网络介导乳腺癌化疗敏感性的机制

摘要

目的：应用BRIT1-siRNA剂敲低乳腺癌细胞BRIT1的表达，探讨BRIT和Mus81在乳腺癌DNA损伤修复反应的作用，从而探索BRIT1-Mus81-BIR调控网络在介导乳腺癌化疗敏感性的机制。
　　方法：使用转染技术敲低BRIT1基因的表达，Western blot技术检测乳腺癌细胞系（468、231）、人正常乳腺上皮细胞系（MCF10A）和人骨肉瘤细胞系（U2OS）中BRIT1和Mus81的表达情况；采用转染技术敲低BRIT1基因的表达并用化疗药物（LY2606368、Irinotecan、CNADC等）分别诱导乳腺癌细胞系（468、231）、人正常乳腺上皮细胞系（MCF10A）和人骨肉瘤细胞系（U2OS）的DNA损伤，应用平板克隆和MTT实验检测乳腺癌细胞增殖活力，RT-PCR实验和IP实验检测BRIT1调节Mus81的机制，Western blot技术检测细胞系中BRIT1和Mus81的表达情况；然后采用转染技术敲低U2OS细胞系BRIT1、Mus81的表达，转染I-SCEI、GFP质粒，流式检测断裂诱导复制（Break induced replication，BIR）表达情况。
　　结果：敲低BRIT1基因的表达，在化疗药物的干预下，乳腺癌细胞系（468、231）、人正常乳腺上皮细胞系（MCF10A）和人骨肉瘤细胞系（U2OS）中敲低BRIT1基因组比对照组的细胞增殖活力明显下降；敲低BRIT1基因的表达， BRIT1蛋白的表达明显减少，同时Mus81蛋白的表达也明显减少；敲低或过表达BRIT1基因，随后MG132处理细胞，Mus81蛋白的表达明显改变；敲低BRIT1基因的表达，PCR检测Mus81的表达水平并未明显减少；在U2OS细胞中敲低BRIT1的表达，并用IP实验检测发现BRIT1和Mus81之间没有直接作用关系；在整合BIR的U2OS细胞中，分别敲低BRIT1和Mus81的表达后，BRIT1及Mus81的表达都有下降，同时BIR修复也下降；在231细胞中敲低BRIT1基因的表达，癌细胞增殖活力下降；在构建的MCF10A-cyclinE细胞系中，BRIT1被敲低后细胞存活时间长，在构建的MCF10A-Kras细胞系中，BRIT1被敲低后细胞增殖能力减弱，进一步用DOX处理后，细胞增殖能力进一步减弱。
　　结论：在乳腺癌中，BRIT1参与乳腺癌DNA损伤修复过程，是介导化疗敏感性的重要分子。此外，在乳腺癌细胞中BRIT1基因可以调控Mus81蛋白的表达，这种调控机制发生于蛋白水平，且并不是直接作用关系。Mus81是重要的结构特异性核酸内切酶，在DNA损伤修复过程有着重要的作用。BRIT1可以通过调节Mus81的表达来参与BIR修复过程。敲低BRIT1和敲低Mus81后，BIR修复明显减少，癌细胞不能修复由化疗药物造成的DNA损伤，从而导致癌细胞的死亡，增加了化疗药物的敏感性。因此，BRIT1-Mus81-BIR调控网络参与调节乳腺癌化疗敏感性，进一步研究该调控网络可为乳腺癌的治疗提供更多依据。

目录

声明

中英文缩略词表

前言

材料与方法

一、实验材料

1、细胞株

2、主要试剂

3、试剂配制

4、主要仪器和设备

二、实验方法

1. 细胞的复苏及传代培养

2. siRNA转染实验

3. 质粒转染实验

4. MTT 实验

5. 实时荧光定量PCR

6. 免疫共沉淀反应 IP

7. Western Blot检测

8. 流式细胞学检测

9. 统计学处理

结果

（1） BRIT1在乳腺癌中低表达介导了乳腺癌化疗敏感性。

（2） BRIT1基因调控Mus81蛋白的表达

（3） BRIT1调控BIR机制

(4) BRIT1调控BIR修复通路介导乳腺癌化疗敏感性

讨论

参考文献

综述：BRCA1乳腺癌和PARP1抑制剂治疗

致谢