Munc13-1 MUN结构域在突触囊泡启动过程中的作用机制研究

摘要

突触囊泡的分泌过程以SNARE蛋白syntaxin-1，SNAP-25，synaptobrevin组装成致密的四螺旋结构复合物为核心机制，同时受到Munc18-1以及Munc13-1等多种蛋白的严格调控。本课题综合运用X-射线晶体学、生物化学以及体外膜重建、电生理等实验技术，深入研究了Munc13-1重要功能片段MUN结构域调控突触囊泡分泌启动过程的功能机制，结果如下：
　　获得了大鼠Munc13-1MUN结构域三维晶体结构。设计Munc13-1MUN结构域包括A、B、C、D全部四个亚结构域的结构片段MUN933，并获得MUN933分辨率为2.9的晶体结构。MUN结构域结构呈一系列α-螺旋束排列形成的狭长拱形，其中部亚结构域B同C接合处存在一个高度保守的疏水口袋。
　　鉴定了大鼠Munc13-1MUN结构域介导syntaxin-1打开作用的关键活性位点。在以Munc18-1–syntaxin-1复合物起始的SNARE复合物组装以及SNARE复合物组装介导的体外膜融合体系中，位于疏水口袋的高度保守氨基酸Asn1128、Phe1131（NF）突变后导致Munc13-1MUN结构域失去催化打开Munc18-1–syntaxin-1复合物的活性。
　　证明了UNC-13-Munc13MUN结构域关键活性位点在突触囊泡启动过程中的重要调控作用。在成年秀丽隐杆线虫体壁肌肉的神经肌肉连接头（NMJs）处记录兴奋性突触后电流（EPSC），MUN结构域NF位点对于自发和诱发性释放至关重要，突变后导致NMJs突触囊泡无法启动。
　　此前，UNC-13-Munc13MUN结构域是神经递质释放过程中唯一缺少三维结构的基本要素，本课题获得并解析出的大鼠Munc13-1蛋白完整且具活性的MUN结构域晶体结构填补了这一空白，为UNC-13-Munc13s在突触囊泡分泌过程中的作用机制研究提供结构依据。发现UNC-13-Munc13MUN结构域催化打开syntaxin-1同时促进SNARE复合物组装介导的膜融合的关键活性位点，并证明该活性位点在突触囊泡分泌启动过程中发挥重要作用，为以下观点提供了可靠的数据支持：MUN结构域对于Munc18-1–syntaxin-1复合物起始的SNARE复合物组装的关键调控作用，是UNC-13-Munc13s在突触囊泡启动过程中发挥核心功能的机制所在。

目录

声明

1 绪论

1.1 突触囊泡分泌基本步骤

1.2 SNARE复合物介导的突触囊泡分泌

1.3 SM蛋白

1.4 MUN结构域蛋白

1.5 拴系因子

1.6 本研究目的意义及主要内容

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验原理与方法

3 结果与分析

3.1 Munc13-1 MUN结构域的晶体结构

3.2 MUN结构域一保守疏水口袋是催化打开syntaxin-1的活性中心

3.3 NF是MUN结构域催化打开syntaxin-1的关键活性位点

3.4 NF定位于MUN结构域保守疏水口袋

3.5 NF是MUN结构域催化膜融合的关键活性位点

3.6 NF是UNC-13-Munc13s催化突触囊泡启动的关键活性位点

4 讨论

5 总结与展望

致谢

参考文献

附录1 攻读学位期间发表的论文

附录2 本文所用到的主要缩略语