机械敏感TRP离子通道蛋白在创伤性轴索损伤发生发展中的初步研究

摘要

研究背景:创伤性脑损伤（TBI），是指机械性外力作用于头部时发生的脑组织损伤。创伤性轴索损伤（TAI）是指头部在特殊外力作用下引发脑组织内部产生剪切力，进而导致发生的以神经轴索和微血管断裂为主要特征的脑白质损伤，是导致TBI患者死亡、残疾和植物状态生存的最常见原因之一，常见于闭合性颅脑损伤（CHI）。文献报道，TAI在造成非占位性病变的TBI患者伤残和死亡的人数中至少占35%。与其他颅脑损伤类型不同的是，TAI并不是由外力直接作用于脑白质而产生的，其产生机制主要是头部在快速加速或减速过程中，由于大脑各结构如脑灰质、白质质地差异造成相对位移而产生的剪切力损伤。TAI在临床诊治中无突破性进展，且在法医学鉴定中也较少应用，究其原因主要是剪切力致神经轴索损伤的作用及机制不明，而且缺乏可靠的早期诊断指标。
　　尽管细胞内 Ca2+超载是 TAI发病的中心环节已经得到公认，但是颅脑外伤的剪切力信号是如何致神经胞浆Ca2+升高的途径尚不清楚，目前存在的多个理论均不能完全解释细胞内 Ca2+超载，故剪切力致神经胞浆 Ca2+升高的途径进而导致神经轴索损伤的作用及机制尚需要进一步研究。
　　瞬间受体电位通道（TRP channels）是一种非选择性阳离子通道，对Ca2+、Na+、Mg2+等均有通透性，最公认的功能是调节细胞内钙离子平衡。同时 TRP离子通道属于机械敏感离子通道（MS），该类离子通道可因细胞膜所受张力变化而呈相应的开关变化，从而使得施加在细胞膜上的机械力信号转换成电信号和相关的生化信号。综上，TRP离子通道在机械力信号（剪切力信号）和细胞内Ca2+超载（生化信号）之间可能存在桥梁关系。我们前期对大鼠脑干组织进行了“神经生物学离子通道和转运蛋白 PCR芯片”检测，研究结果初步显示在大鼠 DAI模型伤后72小时脑干组织Trpc1及Trpv3基因与对照组相比表达明显增加。
　　基于以上理论基础，推断TRP离子通道在神经元损伤，特别是TAI的发生发展中扮演着重要的角色。本实验通过研究 TAI视神经牵拉损伤模型中TRPC1及TRPV3离子通道蛋白不同时间点含量的变化规律，以及通过非特异性的TRPC1及TRPV3离子通道阻断剂来进一步研究此两类TRP离子通道亚型与TAI之间的关系及分析其可能机制，为TAI的临床诊治和法医学鉴定提供理论和研究基础。
　　研究目的:
　　1.通过建立大鼠视神经牵拉损伤体内模拟TAI实验动物模型，观察轴索损伤后的病理变化，检测TRPC1及TRPV3离子通道蛋白的表达水平及变化规律。
　　2.通过使用TRPC1和TRPV3离子通道非特异性阻断剂SKF-96365及2-APB阻断离子通道，以此来观察其对轴索损伤的影响，探讨TRPC1和TRPV3离子通道在介导TAI发生发展中可能的作用机制。
　　材料和方法:
　　1.将具有相似遗传背景的健康成年雄性SD实验大鼠（400g~450g）随机分为假手术组、TAI实验组、干预组（包括SKF-96365+TAI干预组、2-APB+TAI干预组）和干预对照组，大鼠视神经牵拉损伤（ONSI）建立创伤性轴索损伤 TAI模型。其中 TAI组、干预组及干预对照组分0h、12h、24h、48h和72h五个时间点进行观察，每组大鼠7只。
　　2.参照Gennarelli方法建立TAI视神经牵拉损伤模型，应用苏木精-伊红染色及NF-L免疫荧光染色方法确立大鼠TAI模型建立成功。其中假手术组只做外眦剪开及巩膜分离，未做视神经牵拉。TAI实验组做外眦剪开、巩膜分离以及视神经牵拉。干预组：SKF-96365干预组在牵拉致伤前30分钟于牵拉侧球后局部注射一定量溶于DMSO的SKF-96365，其对照组注射等量的DMSO；2-APB干预组在牵拉致伤前30分钟给予2-APB腹腔注射（2.5mg/kg）,以后每天给以等量2-APB腹腔注射，直到处死时间点，其对照组腹腔注射等量的DMSO。
　　3.在规定的时间点将大鼠腹腔麻醉处死，并迅速取出视神经组织，置于4%的多聚甲醛固定或快速冷冻后OCT包埋或置于-80℃冰箱冷冻管保存。
　　4.采用HE染色和免疫荧光方法检测NF-L的表达情况，观察收缩球的数量、直径及分布范围，用于判断轴索损伤的严重程度；采用免疫荧光方法检测TRPC1以及TRPV3的蛋白表达水平及分布情况；视神经组织中的TRPC1及TRPV3的表达量通过Western blotting进行检测。
　　结果:
　　1. TAI实验组各个时间点视神经的病理学改变主要包括，轴索迂曲、增粗，空泡结构，可以观察到收缩球形成。HE染色和免疫荧光均显示典型收缩球的范围随存活时间延长而逐渐扩大，数量增加，直径大小也逐渐增加。假手术组视神经偶见粗大轴索，未检见收缩球形成。
　　2.免疫荧光显示TAI干预组（包括SKF-96365干预组和2-APB干预组）伤后各个时间点NF-L阳性轴索范围、数量及直径均低于同时间点的TAI实验组，且2-APB干预组比SKF-96365干预组更为明显。
　　3.与对照组相比，TAI实验组TRPC1以及TRPV3的蛋白表达量均显著增加；TRPC1表达量在伤后48h内表达量随时间延长而增加，伤后72h表达量较48h回落，但仍高于对照组；TRPV3在伤后表达量增加，但没有明显趋势。
　　4.免疫荧光显示TAI干预组（包括SKF-96365干预组和2-APB干预组）伤后各个时间点TRPC1蛋白及TRPV3蛋白表达量均低于同时间点的TAI实验组；2-APB干预组与SKF-96365干预组相比，TRPC1表达量更低。
　　5.Western blotting检测进一步验证了免疫荧光的结果。
　　结论:
　　1. TRPC1和TRPV3离子通道蛋白表达在TAI发生后出现上调。
　　2. TRPC1和TRPV3离子通道参与TAI时轴索损伤，应用TRP离子通道非特异性阻断剂SKF-96365及2-APB可以减轻TAI损伤的严重程度，TRPC1和TRPV3离子通道可能参与TAI的发生发展。

目录

声明

主要缩略语英文对照

前言

1 材料和方法

1.1实验对象和分组

1.2主要实验仪器及器械

1.3主要实验试剂

1.4实验溶液的配制

1.5动物模型的制作及阻断剂干预组制作

1.6标本取材

1.7大鼠视神经切片制备及染色

1.8大鼠视神经TRPC1及TRPV3的Western Blot检测

1.9统计学分析

2.实验结果

2.1动物行为学及取材观察

2.2 TAI实验组HE染色结果

2.3 TAI实验组检测结果

2.4 2-APB干预组检测结果

2.5 SKF干预组检测结果

3.讨论

4．结论

参考文献

综述:弥漫性轴索损伤的研究进展

附录

一、攻读硕士学位期间发表以及待发表的论文

二、攻读硕士学位期间参与的课题及参加的全国性学术活动

致谢