CXCR3可变剪接体介导由CXCL9诱导的CD133+肝癌细胞的促转移作用及机制研究

摘要

背景与目的：
　　肝癌（HCC）是常见恶性肿瘤，易发生早期转移，肝癌患者死亡率居我国恶性肿瘤致死率的第三位。乙肝（HBV）是肝癌的主要病因，与非HBV肝癌肿瘤相比较，HBV相关性肝癌更易发生早期血行转移。肿瘤干细胞假说认为并非所有癌细胞都能抵抗药物和免疫杀伤等作用，而肿瘤干细胞具有上述抗性，是肿瘤患者发生转移和复发的根源，CD133是重要的肝癌干细胞标记物。既往研究表明，HBV中的HBX基因可上调肝癌细胞趋化因子 CXCL9。趋化因子及其受体作为肿瘤微环境中重要组成部分，对肿瘤干细胞的侵袭和转移有重要调节作用。本研究旨在研究 CXCR3可变剪接体在CXCL9诱导下对CD133+肝癌细胞转移中的机制研究，以期为肝癌早期发现和治疗寻找潜在的干预靶点。
　　方法：
　　1）收集临床上诊断明确的肝癌手术患者的癌组织和癌旁组织。同时采集肝癌患者的临床资料并进行定期随访（每隔3个月电话随访一次）。通过免疫组织化学（IHC）、定量聚合酶链反应(q-PCR)、蛋白质印迹法(Western blot, WB)等实验方法来检测CXCR3在肝癌组织的表达水平。分析CXCR3表达与肝癌手术患者预后及临床病理特征的关联。2）利用流式细胞仪分选出CD133+肝癌细胞，继而利用免疫细胞化学和免疫荧光化学检测 CD133+肝癌细胞的 CXCR3受体的表达。利用 Transwell实验（铺Matrigel胶）和划痕实验来验证CXCL9不同浓度对CD133+肝癌细胞的侵袭和迁移能力。通过过表达质粒和siRNA分别高/低表达CXCR3-A和CXCR3-B受体剪接体，验证CXCL9促进CD133+肝癌细胞侵袭和转移所依赖的受体剪接体。并通过WB实验检测在 CD133+肝癌细胞中有促转移效应的 CXCR3受体剪接体的信号通路。并且采用CCK8试剂检测细胞黏附能力。在裸鼠体内检测CXCR3受体剪接体对CD133+肝癌细胞的转移效应。3）CD133+肝癌细胞与人脐静脉内皮细胞（HUVEC）共培养，包括直接接触共培养、间接接触共培养和CD133+肝癌细胞培养。采用Transwell实验方法来检测共培养实验中的培养基上清对CD133+肝癌细胞趋化作用。采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测共培养实验中培养基上清中 CXCL9的表达。流式分选直接接触共培养的CD133+肝癌细胞和HUVEC细胞，之后利用WB实验来验证培养上清中CXCL9上调的机制。
　　结果：
　　采用肝癌组织和邻近的癌旁组织相比较，IHC结果示癌组织中CXCR3高表达于相相对应的邻近的癌旁组织，CXCR3主要表达于肝癌细胞胞浆和细胞膜中，并且集中在脉管区周边表达。q-PCR和WB实验示，癌组织中的CXCR3的mRNA和蛋白表达水平明显高于癌旁组织。结合临床资料分析示CXCR3高表达与肿瘤大小，肿瘤分化程度，门脉侵袭和转移密切相关。2）利用ICC和IFC实验示了CD133+肝癌细胞中表达CXCR3受体。Tranwell实验和划痕实验示CXCL9浓度为0ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml时其对 CD133+肝癌细胞（包含了 CD133+ PLC/PRF/5细胞、CD133+Hep-3B细胞和CD133+Huh7细胞）的侵袭和迁移能力逐渐上升，在100ng/ml时其趋化CD133+肝癌细胞的能力最强。随后利用CXCL9100ng/ml在不同时间点刺激CD133+肝癌细胞结果示p-ERK1/2磷酸化水平、MMP2和MMP9明显上调；WB和Transwell实验进一步研究发现CXCL9的促侵袭和迁移效应依赖于CXCR3-A剪接体；MMP2和MMP9的上调依赖于CXCR3-A剪接体和p-ERK1/2。黏附实验中采用CCK8检测，结果示 CXCL9可抑制 CD133+肝癌细胞的黏附能力。对于 CD133+PLC/PRF/5细胞、CD133+Hep-3B细胞，CXCL9浓度为100ng/ml时抑制效应最强，而对于CD133+Huh7细胞，CXCL9浓度为50ng/ml和100ng/ml时均可显示出最强抑制效应。并且证实CXCL9对CD133+肝癌细胞的黏附是依赖结合于CXCR3-A剪接体。随后在裸鼠实验中证实 CXCR3-A剪接体促进 CD133+肝癌细胞的转移灶形成，而CXCR3-B与对照组无明显统计学差异。3）在 CD133+ PLC/PRF/5细胞和 CD133+Hep-3B细胞分别与HUVEC细胞共培养的实验中，结果示CD133+肝癌细胞（在此只包含CD133+PLC/PRF/5细胞和CD133+Hep-3B细胞）与HUVEC细胞直接接触共培养时其培养上清显示出更强的对CD133+肝癌细胞的侵袭和迁移能力，相比于非直接接触共培养组和CD133+肝癌细胞单独培养组。进一步研究证实培养上清中高表达的CXCL9趋化因子在促CD133+肝癌细胞的侵袭转移中起重要作用，并且CXCL9的高表达主要是通过活化CD133+肝癌细胞中的NF-kB。在加入NF-kB抑制剂或者CXCL9中和抗体后直接接触组的培养上清对CD133+肝癌细胞的趋化能力明显下降。
　　结论：
　　CXCR3在临床肝癌组织中高表达，与肿瘤大小，肿瘤分化程度，门脉侵袭和转移密切相关。CXCR3-A剪接体，由 CXCL9诱导可导致 MAPK信号通路中支路 ERK1/2磷酸化水平的显著变化，并从而上调的MMP2和MMP9的表达，促进CD133+肝癌细胞的侵袭和转移。在裸鼠体内也证实CXCR3-A的促肿瘤转移能力。此外，过表达CXCR3-A可抑制24小时CXCL9诱导后的CD133+肝癌细胞的黏附能力。CD133+肝癌细胞与HUVEC直接接触共培养组（一定程度上可模拟肿瘤细胞跨内皮屏障时与内皮细胞接触的情景）的培养上清中CXCL9高表达，从而促进CD133+肝癌细胞转移。综上，CXCR3-A介导由CXCL9诱导的肿瘤细胞对细胞外基质的降解及随后的侵袭转移，CXCL9在肿瘤细胞跨内皮屏障可能有重要的潜在作用。干预 CXCL9/CXCR3-A有望成为肝癌转移的治疗靶点。

目录

声明

华中科技大学博士学位论文创新点概述

英文缩略词表

前言

第一部分 肝癌组织中CXCR3的表达水平及其与肝癌患者的临床病理特征的联系

1、材料和方法

2、结果

3、讨论

第二部分 CXCR3剪接体对CD133+肝癌细胞的侵袭转移中的作用和机制

1、材料和方法

2、结果

3、讨论

第三部分 内皮细胞/CD133+肝癌细胞共培养系统诱导的CXCL9在肿瘤跨内皮迁移中的潜在作用

1、材料和方法

2、结果

3、讨论

课题展望

参考文献

综述:CXCL9：其在肿瘤进展中的作用的证据和矛盾

附 录 1 实验中主要仪器设备及主要试剂配制主要仪器设备

附录2 主要试剂的配制

致谢