MM微泡传递piRNA-823调节骨髓微环境参与MM发病的机制研究

摘要

目的：探索人多发性骨髓瘤细胞来源的微泡对骨髓微环境中内皮细胞的影响，并探讨其可能的作用机制，以深入了解MM的发病机理。
　　方法：1、临床资料
　　收集36例初治MM患者外周血标本，提取血浆微泡和PBMC，RT-PCR方法检测MM患者血浆微泡中piRNA-823的表达水平，并分析其与肿瘤分期、分型等临床特征的相关性。
　　2、体外实验
　　（1）采用透射电镜证实MM-MVs的存在；以CFSE染色MM-MVs，Cy3标记piRNA-823，DAPI染色EA.hy926细胞胞核，激光共聚焦显微镜下观察；
　　（2）比较人MM细胞系及患者CD138+细胞来源微泡与细胞内piRNA-823的表达水平；
　　（3）EA.hy926与MM细胞系及MM-MVs共培养后，测定细胞内piRNA-823的表达水平；
　　（4）体外合成piRNA-823-mimic、inhibitor，使piRNA-823在细胞中过表达或沉默，由此来构建实验分组：空白组、转染阴性对照组、转染piRNA-823-mimic组，+8226-MVs组，+8226转染阴性对照后的MVs组，+8226转染inhibitor后提取的MVs组。
　　1）处理后各组EA.hy926细胞用CCK8法检测细胞的增殖；
　　2）Western Blot法检测细胞凋亡蛋白BAX、BCL2、Caspase-3的表达；
　　3）流式细胞术检测各组内皮细胞ICAM-1、NO、ROS、CXCR4的表达；
　　4）ELISA法检测各组细胞分泌VEGF、IL-6的水平；
　　5）体外Transwell实验和小管形成实验检测对内皮细胞迁移和小管生成能力的影响；
　　3、皮下移植瘤模型观察MM-MVs传递piRNA-823对NOD/SCID小鼠成瘤的影响，免疫组化法（CD31）比较瘤体内微血管密度；
　　结果：1、MM患者外周血微泡中piRNA-823表达水平显著高于单个核细胞，且随肿瘤分期递增患者血浆微泡中piRNA-823表达水平更高；
　　2、体外实验结果
　　（1）透射电镜下观察到直径约为0.1-1μm的球形MVs，证实了微泡的存在，激光共聚焦显微镜证实微泡可以携带piRNA-823进入EA.hy926细胞内与其直接融合而发挥作用。
　　（2）MM细胞系来源微泡较其细胞piRNA-823表达显著上调，原代浆细胞来源微泡较细胞piRNA-823表达亦上调。
　　（3）piRNA-823在EA.hy926中的表达量很低，但与MM细胞系培养后，EA.hy926细胞piRNA-823的表达量上调；与MM-MVs共培养后，其细胞内piRNA-823的表达量亦上调，且后者上调更显著。
　　（4）体外证实piRNA-823-mimic转染组、+MVs组均能促进EA.hy926细胞的增殖，抑制凋亡相关蛋白的表达，增加NO释放，减少ROS释放；而沉默piRNA-823的MVs处理组则抑制EA.hy926细胞的增殖，促进凋亡相关蛋白的表达，降低NO释放，增加ROS释放。
　　（5）体外实验证实piRNA-823-mimic转染组，+MVs组均能促进VEGF、IL-6分泌，促进ICAM-1和CXCR4的表达，促进小管形成和内皮细胞迁移，从而促进血管新生；而沉默piRNA-823的MVs处理组则抑制VEGF、IL-6分泌，抑制ICAM-1和CXCR4的表达，抑制小管形成和内皮细胞迁移，从而抑制血管新生。
　　3、体内实验证实piRNA-823-mimic转染组和+MVs处理组，小鼠成瘤的时间更早且瘤体更大，而沉默piRNA-823的MVs处理组瘤体体积较小；+MVs组和mimic转染组较control组瘤体内微血管密度显著增加，而沉默piRNA-823后的MVs作用组则抑制瘤体内微血管的形成。
　　结论：MM-MVs传递piRNA-823影响骨髓微环境中的内皮细胞，促进血管新生，构建一个有利于MM细胞生长和转移的局部微环境，阻断MM-MVs的释放或干扰微泡内容物的传递可能会成为阻止肿瘤疾病进展的一种新策略。

目录

声明

英文缩略词表

前言

材料与方法

一、实验材料

二、实验方法

实验结果

一、MM患者血浆微泡中piRNA-823表达水平较其PBMCs显著升高

二、透射电镜下可观察到球形MM-MVs

三、激光共聚焦显微镜下观察到MM-MVs携带piRNA-823进入内皮细胞

四、MM-MVs可浓缩MM细胞内的piRNA-823

五、qRT-PCR证实微泡可携带piRNA-823进入内皮细胞

六、MM-MVs可传递piRNA-823影响EA.hy926细胞增殖

七、MM-MVs可传递piRNA-823影响EA.hy926细胞凋亡

八、MM细胞可通过微泡传递piRNA-823影响内皮细胞的氧化应激水平

九、MM-MVs传递piRNA-823影响内皮细胞的粘附、迁移功能

十、体内外小管形成实验证实MM-MVs通过piRNA-823影响内皮细胞的小管形成

十一、MM-MVs传递piRNA-823影响内皮细胞分泌IL-6、VEGF

十二、体内实验证实MM-MVs传递piRNA-823影响小鼠成瘤

讨论

总结

参考文献

综述：不同来源细胞外囊泡在造血系统疾病中的研究进展

附录 论文发表

致谢