Dll4/Notch4-ephrin-B2调控血管内皮祖细胞改善胎盘血管内皮损伤的研究

摘要

本文分为以下几个部分:
　　第一部分:ephrin-B2调节EPC功能在子痫前期发病机制中的作用
　　目的:
　　探讨ephrin-B2在子痫前期胎盘和血管内皮祖细胞（EPCs）中的表达及其对胎盘血管生成的影响。
　　方法:
　　1.实验分组：子痫前期组和对照组；提取两组孕妇脐血EPCs及晚孕期胎盘组织；
　　2.采用qRT-PCR及Western Blot检测两组EPCs及胎盘组织中的ephrin-B2表达；
　　3.Ephrin-B2的调控：
　　4.了解转染效率：采用qRT-PCR及Western Blot检测各转染组ephrin-B2mRNA和蛋白水平的表达；
　　5.检测各组转染EPCs的生物学功能：分别采用CCK-8法、Transwell实验、重悬贴壁法测定细胞的活力、迁移能力和分化能力；采用H UV EC小管形成实验分析各组EPCs上清液的促血管形成能力。
　　结果:
　　1.子痫前期组EPCs和胎盘组织中ephrin-B2的表达均明显高于对照组。
　　2.子痫前期组EPC细胞数量与ephrin-B2的表达水平呈负相关性。
　　3.ephrin-B2抑制组的EPCs中ephrin-B2mRNA表达和蛋白表达水平降低；过表达组EPCs中ephrin-B2表达则显著升高。
　　4.转染24小时后，ephrin-B2抑制组c的活性升高，已分化的梭形细胞数目以及梭形细胞占细胞总数的比例增加，迁移细胞数目升高，且抑制组上清液培养的HU V EC形成的小管及管腔分支点数增多。
　　5.转染24小时后，ephrin-B2过表达组EPCs的活性、分化能力、迁移能力及促HUVEC形成小管的能力均降低。
　　结论:
　　子痫前期组EPCs和胎盘组织的ephrin-B2表达明显增加；ephrin-B2可显著抑制EPCs的增殖、迁移、分化和促小管形成能力。据此推测，ephrin-B2可能通过抑制EPC细胞的生物学功能，促进胎盘内皮损伤及子痫前期的发生。
　　第二部分:Dll4/Notch信号通路通过调控ephrin-B2对EPC功能的影响
　　目的:
　　研究EPCs中Dll4/Notch信号通路对ephrin-B2表达的调控及对EPC功能的影响。
　　方法:
　　1.激活Dll4/Notch信号通路：使用Notch通路配体sDll4刺激EPCs（Dll4组）；
　　2.阻断Dll4/Notch信号通路：利用Notch通路抑制剂DAPT培养EPCs（DAPT组）；
　　3.了解Dll4/Notch信号通路对ephrin-B2表达的调节：采用qRT-PCR及Western Blot检测加药处理后各组细胞ephrin-B2mRNA和蛋白水平的表达；
　　4.检测Dll4/Notch信号通路对EPCs生物学功能的影响：加药处理后24h，分别采用CCK-8法、Transwell实验、重悬贴壁法测定细胞的活力、迁移能力和分化能力；采用HUVEC小管形成实验分析各组EPCs上清液促血管形成能力。
　　结果:
　　1.Dll4/Notch信号通路被激活后，ephrin-B2mRNA表达和蛋白表达明显升高；EPCs的增殖活性降低；迁移细胞数目减少；已分化的梭形细胞数以及梭形细胞占细胞总数的比例降低；Dll4组上清液培养的HUV EC小管及管腔分支点数减少。
　　2.Dll4/Notch信号通路被阻断后，ephrin-B2mRNA和蛋白表达明显减少；EPC细胞的活力、分化能力、迁移能力和促小管形成能力均显著升高。
　　结论:
　　激活Dll4/Notch信号通路可以增加EPCs中ephrin-B2的表达，同时抑制细胞的增殖、迁移、分化和促小管形成能力；阻断Dll4/Notch信号通路则产生相反的效应。研究提示，ephrin-B2作为Dll4/Notch信号通路的下游基因在EPCs中发挥作用，形成Dll4/Notch-ephrin-B2级联通路。
　　第三部分:Dll4/Notch-ephrin-B2级联通路特异性受体Notch4参与调控EPC功能
　　目的:
　　明确Dll4/Notch-ephrin-B2级联通路在EPCs中的特异性受体及其对EPCs生物学功能的调控。
　　方法:
　　1.下调Notch1表达：转染Notch1抑制质粒至EPCs（Notch1抑制组）；并采用qRT-PCR及Western Blot检测转染细胞Notch1的表达，了解转染效率；
　　2.激活Dll4/Notch信号通路：将sDll4加入Notch1抑制组EPCs中培养24h；
　　3.分析Notch1信号通路对ephrin-B2表达的调节：采用qRT-PCR及Western Blot分别检测加sDll4处理前后Notch1抑制组EPCs中ephrin-B2的表达；
　　4.下调Notch4表达：转染Notch4抑制质粒至EPCs（Notch4抑制组）；并采用qRT-PCR及Western Blot检测转染细胞Notch4的表达，了解转染效率；
　　5.激活Dll4/Notch信号通路：将sDll4加入Notch4抑制组EPCs中培养24h；
　　6.分析Notch4信号通路对ephrin-B2表达的调节：采用qRT-PCR及Western Blot分别检测加sDll4处理前后Notch4抑制组细胞ephrin-B2的表达.
　　结果:
　　1.Notch4抑制组EPCs中Notch4表达明显降低，ephrin-B2表达也相应降低。
　　2.Notch4抑制后，再用Dll4激活EPCs的Notch通路，ephrin-B2表达无明显改变。
　　3.Notch1抑制组EPCs中Notch1表达明显降低，但ephrin-B2表达升高。
　　4.Notch1抑制后，再用Dll4激活EPCs的Notch通路，ephrin-B2表达进一步增加。
　　5.Notch4抑制组的EPCs活性升高；迁移细胞数目增加；已分化的梭形细胞数目及其占比例明显增加；上清液培养的HUVEC小管和管腔分支点数增多。
　　结论:
　　抑制Nocth4表达可提高EPC细胞的活性，并促进细胞迁移、分化和促小管形成能力。Notch4为Dll4/Notch-ephrin-B2级联通路的特异性受体。
　　第四部分:血管内皮祖细胞移植改善子痫前期大鼠胎盘血管内皮的损伤
　　目的:
　　将ephrin-B2沉默的EPCs移植到子痫前期大鼠胎盘中，分析移植后孕鼠的血压、妊娠结局和胎盘微血管密度的改变，阐明ephrin-B2对胎盘血管内皮损伤的修复作用。
　　方法:
　　1.建立子痫前期孕鼠模型：L-NAME腹腔注射法；
　　2.制备移植EPCs：采用密度梯度离心法分离正常大鼠骨髓中EPCs，并将ephrin-B2干扰慢病毒或空载慢病毒转入EPCs中；观察绿色荧光表达、qRT-PCR和Western Blot检测ephrin-B2的转染效率；
　　3.将孕鼠进行如下分组，于孕16天进行胎盘注射/移植，
　　①正常对照组：正常妊娠孕鼠，胎盘注射生理盐水；
　　②子痫前期组：子痫前期孕鼠，胎盘注射生理盐水；
　　③治疗组：子痫前期孕鼠，将转染了ephrin-B2干扰慢病毒的EPCs注射至胎盘；
　　④治疗对照组：子痫前期孕鼠，将转染了空载慢病毒的EPCs注射至胎盘；
　　4.孕17、19天测量各组孕鼠血压；
　　5.孕20天处死孕鼠，对胎盘组织进行冰冻切片，通过荧光显微镜观察EPCs移植后体内迁移情况；通过qRT-PCR和Western Blot检查各组胎盘组织ephrin-B2的表达水平；
　　6.比较各组孕鼠妊娠结局和胎盘微血管密度：测量各组胎鼠及胎盘的大小并称重；通过CD34标记的免疫组化测定各组胎盘的微血管密度。
　　结果:
　　1.本实验选取的28只（每组7只）孕鼠，其中治疗组1只死于术后低体温，其余27只均存活。
　　2.转染干扰慢病毒的EPCs中ephrin-B2mRNA和蛋白表达量明显下降；转染空载慢病毒的EPCs中ephrin-B2表达无明显改变。
　　3.注射EPCs的胎盘组织在荧光显微镜下可见大面积绿色荧光，且荧光沿微血管走形分布。
　　4.孕19天时，治疗组和治疗对照组的血压明显低于子痫前期组；治疗组血压低于治疗对照组。
　　5.治疗组胎盘中ephrin-B2表达水平最低，子痫前期组最高，与其他两个对照组相比均有统计学差异。
　　6.与其它三组相比，子痫前期组的胎盘、胎鼠最小；治疗组与治疗对照组相比，胎鼠重量、胎盘直径和胎盘重量有所增加。
　　7.子痫前期组胎盘的微血管密度明显少于两个对照组和治疗组；治疗组胎盘的微血管数量比治疗对照组多，差异有统计学意义。
　　结论:
　　EPCs细胞移植可有效地修复子痫前期胎盘的内皮损伤，促进胎盘血管生成，改善孕鼠的血压及妊娠结局；抑制ephrin-B2表达的EPCs移植组比正常EPCs移植组的孕鼠妊娠结局更好，新生的胎盘血管更多，对损伤的内皮修复地更彻底。

目录

声明

前言

参考文献

第一部分 ephrin-B2 调节 EPC功能在子痫前期发病机制中的作用

引言

材料和方法

实验结果

讨论

参考文献

第二部分 Dll4/Notch信号通路通过调控ephrin-B2对EPC功能的影响

引言

材料和方法

实验结果

讨论

参考文献

第三部分 Notch4作为Dll4/Notch-ephrin-B2级联通路特异性受体调控EP C功能

引言

材料和方法

实验结果

讨论

参考文献

第四部分 血管内皮祖细胞移植改善子痫前期大鼠胎盘血管内皮的损伤

引言

材料和方法

实验结果

讨论

参考文献

综述:内皮功能障碍与子痫前期

附录

附录一中英文缩略词对照表

附录二博士期间发表论文

致谢