慢病毒介导shRNA沉默乳腺癌MCF-7细胞MTDH基因对紫杉醇敏感性影响的研究

摘要

目的：
　　乳腺癌已成为女性最常见的恶性肿瘤之一。化疗是治疗乳腺癌的主要手段之一，但由于获得性耐药导致化疗失败却是临床治疗中的一个重大挑战。MTDH原癌基因对促进肿瘤细胞的增殖、肿瘤血管生成,引起凋亡抑制有重要作用，并与肿瘤细胞侵袭、扩散、转移及化疗耐药密切相关。本实验通过研究MTDH基因沉默对乳腺癌MCF-7细胞增殖及对紫杉醇耐药性的影响，为乳腺癌的基因治疗及逆转化疗耐药提供实验理论依据。
　　方法：
　　本实验成功构建慢病毒介导MTDH基因沉默的MCF-7稳转细胞株（命名为MCF-7-MTDH/knockdown）和阴性对照病毒稳定转染的乳腺癌细胞株（命名为MCF-7-control）。采用Real-time PCR和Western blot法检测空白对照组（MCF-7）、阴性对照组（MCF-7-control）、实验组（MCF-7-MTDH/knockdown）的MTDH mRNA和蛋白质表达水平验证转染效果。CCK-8法绘制沉默前后MCF-7细胞株的生长曲线，并通过CCK-8法检测沉默MCF-7细胞MTDH基因对紫杉醇药物敏感性的影响。流式细胞术检测沉默前后细胞周期及紫杉醇对细胞周期和凋亡的影响。Real-time PCR和Western blot法检测 NF-κB P65，IκBα基因在MCF-7、MCF-7-control、MCF-7-MTDH/knockdown细胞中的mRNA和蛋白质表达水平。通过建立稳定转染细胞的荷瘤裸鼠模型，研究MTDH沉默在体内对紫杉醇敏感性的影响，并对成瘤标本进行流式细胞术检测细胞凋亡情况。应用SPSS21.0统计软件对实验数据进行统计分析，检验以P<0.05为差异有显著性意义。每组实验不少于3个独立样本的重复。
　　结果：
　　1.慢病毒介导MTDH沉默的乳腺癌MCF-7稳转细胞株的构建和鉴定成功构建稳定转染的MCF-7-MTDH/knockdown细胞株和MCF-7-control细胞株。通过 Real-time PCR检测 MCF-7细胞、MCF-7-control细胞、MCF-7-MTDH/knockdown细胞中MTDH基因mRNA表达水平分别为1.001±0.010、1.014±0.018、0.285±0.036。通过Western blot检测 MTDH蛋白在三种细胞中的相对表达量分别为0.871±0.126、0.816±0.067、0.089±0.011。MCF-7-MTDH/knockdown细胞 MTDH基因mRNA表达和蛋白表达均低于两对照组（P＜0.05）。
　　2.MTDH沉默对细胞增殖和细胞周期、细胞凋亡的影响
　　CCK-8法检测各组细胞于0h、24h、48h、72h的增殖情况，实验组MCF-7-MTDH/knockdown细胞增殖速度明显慢于MCF-7和MCF-7-control两对照组（P＜0.01）。
　　流式细胞仪检测各组的细胞周期，结果显示空白对照组、阴性对照组、实验组细胞G0/G1期比例分别为41.61±0.53％、40.27±1.22%、55.70±1.83%；实验组S期和G2/M期比例均减低。与对照对相比实验组细胞G0/G1期延长，S期和G2/M期缩短（P＜0.05）。
　　流式细胞学检测各组的细胞凋亡，结果显示：空白对照组、阴性对照组、实验组细胞的凋亡率分别为4.85±0.64%、5.35±0.56%、10.21±0.29%。实验组MCF-7-MTDH/knockdown细胞凋亡率增加，高于对照两组（P＜0.05）。
　　3.紫杉醇对MTDH基因沉默前后MCF-7细胞增殖和周期、细胞凋亡的影响
　　0.1μg/ml紫杉醇作用48h对三组细胞的抑制率分别为40.71±0.08%、40.96±0.16%、54.25±0.06%；1μg/ml紫杉醇作用48h对三组细胞的抑制率分别为56.54±0.13%、56.49±0.04%、77.19±0.17%。0.1μg/ml、1μg/ml紫杉醇作用48h后对实验组MCF-7-MTDH/knockdown细胞的抑制率均高于两对照组（P＜0.01）。
　　细胞周期检测结果显示：紫杉醇药物可诱导各组细胞G2/M期比例升高，1μg/ml用药组较0.1μg/ml用药组G2/M期比例升高更加明显（P＜0.05）；1μg/ml紫杉醇作用48h后MCF-7-MTDH/knockdown细胞的G2/M期比例明显高于MCF-7、MCF-7-control细胞（P＜0.05）。
　　细胞凋亡情况检测结果显示：各组细胞凋亡率随紫杉醇浓度增加而增加。0.1μg/ml和1μg/ml紫杉醇分别作用48h后,实验组MCF-7-MTDH/knockdown细胞的凋亡率明显高于两对照组（P＜0.001）。
　　4.沉默前后MCF-7细胞NF-κB P65，IκBα基因的表达情况
　　Real-time PCR和Western blot结果显示：MTDH沉默后P65的mRNA和蛋白表达量降低，而IκBα的mRNA和蛋白表达量升高（P＜0.001）。与对照组相比差异有统计学意义。
　　5.MTDH沉默对裸鼠成瘤的影响
　　种植瘤的生长情况：MCF-7-MTDH/knockdown组裸鼠的肿瘤体积（374.35±16.68mm3 vs902.7±26.53mm3 and840.79±25.82mm3）和重量（0.459±0.051g vs1.106±0.095g and1.103±0.101g）明显小于两对照组（P＜0.001），生长速度较对照组明显减慢。
　　种植瘤对紫杉醇敏感性：MCF-7-MTDH/knockdown组裸鼠肿瘤体积(91.13±16.68 mm3 vs340.21±26.35mm3 and322.27±25.82 mm3)和重量(0.113±0.02 vs0.440±0.01 g and0.397±0.03 g)明显小于两对照组（P＜0.001）。
　　流式细胞术检测种植瘤的细胞凋亡：未应用紫杉醇的MCF-7、MCF-7-control、MCF-7-MTDH/knockdown三组种植瘤细胞凋亡率分别为2.477±0.055%、2.823±0.770%、9.527±0.262%。MCF-7-MTDH/knockdown组裸鼠种植瘤凋亡率增加（P＜0.001）。应用紫杉醇后三组种植瘤细胞凋亡率分别为14.547±0.625%、13.320±1.529%、25.613±0.996%。MCF-7-MTDH/knockdown组裸鼠种植瘤凋亡率较两实验组明显增加（P＜0.001）。
　　结论：
　　1.通过慢病毒介导能够成功构建MTDH沉默的MCF-7稳定转染细胞株。
　　2.MTDH沉默可抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖，诱导乳腺癌MCF-7细胞G0/G1期比例升高，促进细胞凋亡。
　　3.MTDH沉默可提高乳腺癌细胞对紫杉醇的敏感性，其分子机制可能与NF-κB/IκB通路抑制有关。

目录

声明

英文缩写

前言

材料与方法

1 材料

2 实验方法

结果

1 慢病毒介导MTDH基因沉默乳腺癌MCF-7稳转细胞株的构建和鉴定

2 MTDH沉默对乳腺癌细胞增殖和细胞周期、细胞凋亡的影响

3沉默前后MCF-7细胞对紫杉醇敏感性的检测

4 沉默前后MCF-7乳腺癌细胞NF-κB P65，IκBα基因的表达情况

5 MTDH沉默对裸鼠成瘤的影响

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述:MTDH基因与乳腺癌耐药的相关机制的研究

致谢

个人简历