心肌细胞缺氧和红景天苷干预的差异性表达蛋白的SILAC定量蛋白质组学分析及线粒体相关的机制研究

摘要

目的:心肌细胞缺氧过程中始终伴随着可能诱导细胞损伤（坏死、凋亡等）的能量代谢变化，这些变化在心血管疾病进程方面起着至关重要的作用。红景天苷(Salidroside，SAL)是红景天的有效成分之一，近年来有研究表明SAL具有抗心肌缺氧、保护心脏功能等作用。本研究旨在通过氯化钴(CoCl2)体外刺激H9c2大鼠心肌细胞制备化学缺氧模型，应用定量蛋白质组学方法分析缺氧组和SAL干预组心肌细胞蛋白表达差异，分析线粒体三羧酸循环相关酶和凋亡相关的线粒体信号途径分子的表达变化，探讨SAL对缺氧心肌的保护作用机制。
　　方法:以H9c2大鼠心肌细胞为靶细胞，使用不同剂量CoCl2刺激H9c2细胞，筛选适宜的CoCl2刺激浓度，对照组加入等量的DMEM高糖培养基;使用不同浓度SAL预处理H9c2细胞不同时间，再以适宜的CoCl2浓度刺激细胞，筛选最佳的SAL保护浓度，对照组加入等量的DMEM高糖培养基。采用稳定同位素标记细胞(SILAC)结合质谱的方法筛选缺氧组、红景天苷预处理组和对照组的差异表达蛋白，运用The Databasefor Annotation，Visualization andIntegrated Discovery(DAVID)生物信息学对数据进行分析。Hochest33342染色观察细胞形态学变化;流式细胞术检测细胞凋亡比例;荧光探针检测细胞内Ca2+浓度变化;化学发光分析法检测细胞内ATP浓度变化;Western Blot检测琥珀酰辅酶A连接酶1(SUCLG1)、琥珀酰辅酶A连接酶2(SUCLG2)、苹果酸脱氢酶2(MDH2)、Cleaved-caspase-3、caspase-9、Bcl-2和Bax蛋白表达。。
　　结果:
　　1 CoCl2对H9c2细胞的半数抑制浓度为500μmol/L:根据文献以CoCl2500μmol/L为中心，双向扩大刺激浓度范围为300，400，500，600和700μmol/L。分别刺激H9c2细胞24 h，对照组加入等量的DMEM培养基。MTT实验结果发现:CoCl2300，400，500，600和700μmol/L组细胞存活率明显受到抑制，与对照组相比有统计学差异（P＜0.05），细胞活性随CoCl2浓度增加呈现递减趋势，进一步实验发现CoCl2对H9c2细胞的半数抑制浓度为500μmol/L，故选取500μmol/L为后续实验中CoCl2的刺激浓度。
　　2常氧状态下SAL对H9c2细胞无明显增殖作用:根据文献以SAL(1，10，100，1000 nmol/L)分别作用于H9c2细胞12，24，36 h，对照组加入等量的DMEM培养基。MTT实验结果发现:当SAL浓度为1000 nmol/L作用于H9c2细胞12，24，36 h时，细胞存活率下降，与对照组相比有统计学差异(P＜0.05); SAL浓度为1，10，100 nmol/L作用于H9c2细胞12，24，36 h时，细胞存活率无明显变化，与对照组相比无统计学差异。结果表明，常氧条件下，SAL对H9c2细胞无明显增殖作用，故选取24 h为后续实验中SAL的作用时间。
　　3低氧状态下SAL使H9c2细胞活力升高:以不同浓度SAL(1，10，100，1000 nmol/L)预处理细胞24 h，随后细胞暴露于500μmol/L CoCl2的低氧环境下持续培养24 h，对照组加入等量的DMEM培养基。MTT实验结果发现:1，10，100，10000 nmol/L SAL均能抑制CoCl2诱导的H9c2细胞毒性作用，并且SAL浓度为100 nmol/L时效果最明显(P＜0.05)，故选取SAL100 nmol/L为后续实验中SAL的预处理浓度。
　　4蛋白质组学和生物信息学的定量比较分析:在稳定同位素正反标记的四个实验组中，共发现5088个蛋白(protein level FDR＜1％)，其中838个同时存在于四个实验组中;进一步实验发现缺氧组与正常组相比，共鉴定到30个上调蛋白和62个下调蛋白;SAL预处理组与缺氧组相比，共鉴定到70个上调蛋白和36个下调蛋白。
　　5基因功能分析:将鉴定有意义的上调和下调蛋白进行DAVID生物学进程和细胞组分分析，结果均表明SAL保护缺氧H9c2细胞的作用机制主要集中于细胞糖代谢如乙酰辅酶A代谢、三羧酸循环(TCA cycle)、氧化呼吸等生理过程，其中SAL对三羧酸循环酶SUCLG1，SUCLG2，MDH1和MDH2的调控作用尤为突出。
　　6 SAL能降低低氧环境诱导的H9c2细胞凋亡:倒置显微镜下观察H9c2细胞的形态学变化发现正常贴壁的H9c2细胞形态为梭形，但经过CoCl2诱导的缺氧刺激后，细胞变成鹅卵石样甚至圆形，细胞皱缩，部分从培养皿底部脱落;同时，这些细胞形态学变化在SAL抗缺氧组的细胞中表现不明显。Hoechst33342实验检测H9c2细胞核水平发现当细胞暴露于500μmol/L CoCl224 h后，与正常组相比，出现细胞核皱缩、染色质凝集、凋亡小体形成等变化，但这些变化在经SAL100 nmol/L预处理24 h的抗缺氧组细胞中不明显。FITC-annexinⅤ和PI双染的流式细胞术实验发现缺氧组的细胞凋亡率显著增加，而SAL100 nmol/L预处理24 h组能明显逆转此趋势。
　　7 SAL能有效提升细胞线粒体膜电位（ΔΨm）
　　8 SAL能维持细胞内外钙稳态:缺氧组细胞较正常组细胞有明显的钙超载趋势，同时红景天抗缺氧组细胞的钙离子荧光信号强度较缺氧组明显削弱（P＜0.05）。
　　9 SAL能有效抑制ROS形成
　　10 SAL能显著抑制CoCl2诱导的ATP大量消耗（P＜0.05）。
　　11 SAL具有调节三羧酸循环的功能:SAL100 nmol/L预处理H9c2细胞24 h，继而持续暴露于500μmol/L CoCl224 h，各组内参β-actin的表达一致; SUCLG1，SUCLG2表达量均较对照组显著降低;MDH2表达量较对照组上调;SAL预处理组能逆转此趋势(P＜0.05)。
　　12 SAL能有效抑制线粒体凋亡途径:与对照组相比，缺氧组caspase9和活化caspase3蛋白表达水平急剧上升;与缺氧组相比，SAL预处理组caspase9和活化caspase3蛋白表达水平明显下降(P＜0.05)。
　　13 SAL能有效调节Bcl-2家族相关蛋白表达从而抑制细胞凋亡:与正常组相比，缺氧能显著下调Bcl-2（抑制凋亡）蛋白表达量，并上调Bax（促进凋亡）蛋白表达量;与缺氧组相比，SAL预处理24 h组能明显逆转上述Bcl-2和Bax表达变化趋势(P＜0.05)。
　　结论:SAL通过调节三羧酸循环相关的催化酶、增高线粒体膜电位水平、抑制ROS生成及线粒体钙超载、调节caspase家族蛋白和Bcl-2家族蛋白表达，发挥对心肌细胞缺氧损伤的保护作用。

目录

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摘要

英文缩写

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 红景天苷对心肌的保护机制及信号通路的研究进展

致谢

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