Notch信号通路在铂耐药性卵巢癌细胞株中作用及机制的初步研究

摘要

目的:上皮性卵巢癌（Epithelial ovarian cancer，EOC）是一种高度恶性的妇科肿瘤，不易早期发现，绝大多数病人在诊断时即已发生局部或全身转移。目前卵巢癌的治疗方法主要为彻底的肿瘤细胞减灭术和以铂类药物为主的化疗。卵巢癌对化疗药物产生耐药性和侵袭转移的发生使其五年生存率徘徊在30％左右，死亡率居妇科恶性肿瘤之首。因此，研究耐药性EOC的转移机制，寻找有效的干预靶点显得尤为迫切。
　　上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)是上皮性肿瘤发生侵袭转移过程中的关键环节，也与化疗抵抗关系密切。在EMT过程中，上皮细胞发生了典型的形态学改变，即由鹅卵石样上皮表型转变为长梭样的间质表型;上皮标志物E-cadherin表达降低，间质细胞标志物如Vimentin、 N-cadherin等表达增加，上皮细胞失去极性，细胞之间连接松散，细胞骨架重塑而获得运动能力。因此，阻断或逆转EMT的发生有望抑制肿瘤的侵袭转移，增强疗效。
　　内源性非编码小RNA(microRNA，miRNA)是一类由20～25个核苷酸组成的短小非编码蛋白质的RNAs，广泛存在于真核生物中。miRNA通过碱基配对结合到靶基因mRNA的3端非编码区(3'untranslatedregions，3'UTR)，导致mRNA降解或翻译抑制，在表观遗传学和基因表达调控方面起到重要作用。miRNAs是上皮癌发生EMT过程的一个关键调节者，其中miR-200家族与卵巢癌关联较多。卵巢癌miR-200c/ZEB1负反馈环路与EMT关系更密切，miR-200c表达减少，增加ZEB1表达，导致E-cadherin表达减少，促进EMT的发生，细胞间黏附性降低，移动性增强。但是miR-200c在癌细胞中的表达调节机制仍未完全阐明。
　　Notch信号通路是一个高度保守的信号传导通路，在细胞发育和决定细胞分化命运过程中起关键作用，该通路的失调与多种癌症的发生及耐药密切相关。在肺腺癌、胰腺癌研究证实，活化Notch信号途径，可降低miR-200c表达，促进肿瘤细胞发生EMT。但Notch信号途径与miR-200c表达在耐药性卵巢癌细胞转移中的作用及其作用机制，需要进一步研究的证实。DAPT是一种人工合成的γ-分泌酶抑制剂，是被公认的Notch信号通路阻断剂。由此，我们推测，miR-200c是notch途径的一个靶向因子，应用DAPT抑制notch-1表达后，可上调miR-200c表达，逆转EMT表型，减弱细胞转移能力。
　　本实验通过体外培养人卵巢浆液性囊腺癌细胞株SKOV3和顺铂耐药人卵巢浆液性囊腺癌细胞株SKOV3/DDP，以DAPT为处理因素，旨在研究Notch信号途径与miR-200c表达在耐药性卵巢癌细胞转移中的作用，并对其作用机制进行探索，以期为上皮性卵巢癌的治疗提供新的思路和实验依据。
　　方法:用含10％胎牛血清RPMI-1640培养基在37℃，饱和湿度5％CO2的培养箱中常规培养SKOV3细胞和SKOV3/DDP细胞。
　　1.倒置显微镜:以SKOV3细胞为阴性对照组，SKOV3/DDP细胞为空白对照组，和不同浓度DAPT(25、50、75μ mol/L)处理SKOV3/DDP细胞为实验组，细胞培养48h后应用倒置显微镜观察细胞形态的变化。
　　2.MTT法:培养SKOV3/DDP细胞进入对数生长期后用不同浓度DAPT(25、50、75μ mol/L)作用不同时间(24h、48h、72h)，以DAPT0μmol/L为空白对照组。采用MTT法检测药物对细胞生长的影响，筛选出药物作用的最适浓度及时间。
　　3.蛋白质印迹(Western blotting):以SKOV3细胞为阴性对照组，SKOV3/DDP细胞为空白对照组，和50μ mol/L DAPT处理SKOV3/DDP细胞为实验组，细胞培养48h后提取总蛋白，应用Nano-drop仪和BCA法检测总蛋白浓度，应用Western blotting检测上皮细胞标记物E-cadherin蛋白和间质细胞标记物Vimentin蛋白表达。
　　4.实时荧光定量PCR(RT-PCR):细胞分组同Western blotting，细胞培养48h后提取总RNA，应用Nano-drop仪检测总RNA浓度，应用RT-PCR检测Notch-1 mRNA和ZEB1mRNA的表达量。用SYBR Green IRT-PCR方法检测miR-200c转录水平的变化情况。
　　5.细胞划痕试验:以SKOV3细胞为阴性对照组，以SKOV3/DDP细胞为空白对照组，以50μ mol/L DAPT处理SKOV3/DDP细胞为实验组，应用无血清培养基同步，加入不同刺激后再做划痕，拍照。48h后再拍照观察不同组间划痕愈合情况的不同。
　　6.应用SPSS16.0统计软件进行数据分析，数据以x±s表示，检验水准α=0.05，P＜0.05差异有统计学意义。
　　结果:
　　1.倒置相差显微镜下观察SKOV3细胞形态为典型的铺路石样，细胞排列规则紧凑;SKOV3/DDP细胞形态为多角星形，伸出伪足，细胞排列不规则，细胞间连接较疏松。在不同浓度DAPT(25、50和75μ mol/L)作用48h后，SKOV3/DDP细胞形态开始发生变化，部分细胞伪足缩短，呈多角形，细胞排列也更紧密。
　　2.MTT与空白对照组相比，随着DAPT作用浓度(25、50和75μ mol/L)的增加和作用时间(24h，48h和72h)的延长，SKOV3/DDP细胞的抑制率明显增加(P＜0.05)。不同浓度DAPT处理72h后各组细胞活力明显下降，细胞死亡更明显。75μ mol/L DAPT处理组细胞在相同时间时抑制率最高，而25μ mol/L处理细胞组的抑制率较低。因此为维持细胞的活力又可发挥药物作用，对于SKOV3/DDP细胞后续实验DAPT的作用浓度选为50μmol/L，将48h定为DAPT作用SKOV3/DDP细胞的最佳时间。
　　3.Western blotting
　　3.1 细胞培养48h后，空白对照组SKOV3/DDP细胞上皮细胞标记物E-cadherin(0.072±0.043)表达较阴性对照组SKOV3细胞(0.867±0.121)明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05);间质细胞标记物Vimentin(3.221±0.238)表达升高，与阴性对照组相比(0.523±0.069)，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　3.2 50μ mol/LDAPT溶液作用于SKOV3/DDP细胞48小时后E-cadherin表达量为(0.324±0.039)，与空白对照组(0.072±0.043)相比，E-cadherin蛋白的表达差异有统计学意义(P＜0.05)。50μ mol/L DAPT处理SKOV3/DDP细胞48h后，Vimentin蛋白的表达(1.873±0.177)相对于空白对照组(3.221±0.238)明显减少(P＜0.05)。
　　4.RT-PCR
　　4.1 SKOV3细胞和SKOV3/DDP细胞中Notch-1 mRNA表达与阴性对照组SKOV3细胞（1.000±0.000）相比，空白对照组SKOV3/DDP细胞中Notch-1 mRNA表达量（2.854±0.600）明显增加(P＜0.05)。应用50μmol/L浓度DAPT作用SKOV3/DDP细胞48h后，与空白对照组相比，Notch-1 mRNA表达量（1.973±0.567）明显减少，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　4.2 miR-200c和ZEB1 mRNA表达变化SKOV3细胞中miR-200c表达量（1.000±0.000）明显低于空白对照组（0.203±0.027），而空白对照组中ZEB1 mRNA表达量(7156.100±581.336)明显高于阴性对照组（1.000±0.000），差异均具有统计学意义(P＜0.05)。应用50μ mol/LDAPT作用SKOV3/DDP细胞48h后，与空白对照组相比，miR-200c表达量（0.430±0.243）增加，而ZEB1mRNA表达量（2527.800±1109.512）减少，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。
　　5.划痕试验:
　　划痕试验步骤和迁移力评估同前，与SKOV3细胞相比，SKOV3/DDP细胞愈合面积明显增加，差异具有统计学意义(P＜0.05）。经50μ mol/L浓度DAPT作用48h后，与空白对照组相比，实验组细胞迁移力明显减弱，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　结论:
　　1.顺铂耐药的SKOV3/DDP细胞的转移力强于顺铂敏感的SKOV3细胞。
　　2.SKOV3/DDP细胞表现为典型的铺路石样上皮细胞类型，E-cadherin蛋白的表达高，Vimentin蛋白的表达低;SKOV3/DDP细胞获得间质类型形态，为不规则多角形，Vimentin蛋白高表达，而E-cadherin蛋白低表达。
　　3.Notch信号通路与miR-200c异常表达相关。应用Notch信号阻断剂DAPT作用SKOV3/DDP细胞后，促进miR-200c表达，减少ZEB1mRNA表达，进而部分逆转EMT，上调E-cadherin蛋白的表达，下调Vimentin蛋白的表达，减弱细胞的转移力。
　　4.Notch信号传导通路、miR-200c异常表达与卵巢癌细胞获得耐药表型和转移能力有关。

目录

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摘要

英文缩写

前沿

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 miRNA-200在卵巢癌耐药和转移中的研究进展

致谢

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